转 H7N9 我国学者新英格兰医学杂志文章！
一种新型禽源性甲型流感（H7N9）病毒的人类感染（1）作者： 来源：中国医学论坛报 日期：2013-04-18高荣保等 中国疾病与预防控制中心国家病毒性疾病控制与预防研究所等
摘要
背景
禽类感染甲型流感亚型H7在世界范围内均有发生，但以前尚未观察到该亚型在亚洲发生人类的感染。2013年3月，中国上海市或安徽省有3名城市居民表现出了快速进展的下呼吸道感染，并发现是感染了一种新型、重配的禽源性甲型流感（H7N9）病毒。
方法
我们获得并分析了这些患者的临床、流行病学和病毒学资料。采用实时逆转录聚合酶链反应检测、病毒培养和序列分析方法，对呼吸道样本进行了流感和其他呼吸道病毒的检测。
结果
我们从所有3例患者获取的呼吸道样本中均分离出了一种新型、重配的禽源性甲型流感（H7N9）病毒，并将该病毒辨别为H7N9。序列分析结果显示，这3株病毒的所有基因均为禽源性。有6个内部基因来自甲型禽流感（H9N2）病毒。在A/安徽/1/2013和A/上海/2/2013病毒株中发现了血细胞凝集素（HA）基因201环处有Q226L（编号为H3）替代，但在A/上海/1/2013病毒中未发现此替代。在3株病毒的HA基因150环处均辨别出了一个T160A突变。在3株病毒中均发现了神经氨酸酶（NA）茎部区域有5个氨基酸缺失。3例患者均表现有发热、咳嗽和呼吸困难。2例患者近期有家禽暴露史。胸部X线片显示有弥漫性不透明片状影和实变。并发症包括急性呼吸窘迫综合征和多器官衰竭。3例患者均死亡。
结论
新型、重配的H7N9病毒与这3例患者的严重和致死性呼吸系统疾病相关。
甲型禽流感病毒的散发性人类感染（通常发生于近期暴露家禽后）引起了一种广泛表现的疾病，范围从结膜炎、上呼吸道感染到肺炎和多器官衰竭。甲型低致病性禽流感（H7N2、H7N3、H9N2或H10N7）1-4病毒感染已经引起严重程度为轻微（结膜炎或无并发症的流感样疾病）至中度的下呼吸道感染。甲型高致病性禽流感（HPAI）（H7）病毒的大多数人类感染均引起结膜炎（H7N3）或无并发症的流感疾病，但有报告显示，在荷兰的一次暴发期间，1例H7N7病毒感染的病例发生了致死性急性呼吸窘迫综合征（ARDS）1，5。相反，对于报告的HPAI H5N1病毒感染病例，自2003年以来的累计致死率大约为60%6-8。
目前只在亚洲报告了罕见的H7病毒向哺乳动物的传播。全球任何地方均无记录到的N9亚型病毒的人类感染。在2013年2月和3月，3例患者因不明原因的严重下呼吸道疾病而入院。我们报告与这些感染相关的一种新型、重配禽源性甲型流感（H7N9）病毒的辨别。
方法
监测、报告和数据收集
采集3例因严重双侧肺炎、白细胞减少和淋巴细胞减少而住院的中国成年患者（2例来自上海市和1例来自安徽省）的咽拭子标本，并将标本分别送至上海公共卫生临床中心、上海疾病控制和预防中心（CDC）及安徽CDC。在初步检出呼吸道病原体后，样本于2013年3月25日被送至到中国国家流感中心（CNIC）。
采用一种标准化监测报告表来收集流行病学数据和临床数据，包括人口统计学特征，潜在疾病，季节性流感病毒疫苗接种史，最近暴露于猪、家禽或其他动物，最近到过活动物市场，临床体征和症状，胸部X线结果，实验室检查结果（包括流感和其他呼吸道病毒在内的诊断性检测），抗病毒治疗，临床并发症，以及转归。禽源性甲型流感（H7N9）病毒人类感染的确诊病例定义为有肺炎以及有H7N9病毒RNA或在CNIC从呼吸道标本中分离出H7N9病毒的证据。
http://pic2.cmt.com.cn/WebImages/46193/46193_cc0e452b-fbc2-4165-834a-8bdfff72804b.jpg 病毒分离
将采集自所有3例患者的咽拭子标本均保存在病毒转移培养基中。将标本接种到第9～11天、特异的无病原体鸡胚尿膜囊和羊膜腔中，并在35℃下（培养）增殖48～72小时。
RNA提取物和实时RT-PCR
我们使用QIAamp Viral RNA Mini Kit（Qiagen），并按照生产商的用法说明从咽拭子标本中提取了RNA。我们使用了针对季节性流感病毒（H1、H3或B）、H5N1、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和新型冠状病毒的特异性实时逆转录酶-聚合酶链反应（RT-PCR）检测。然后，我们采用自己设计的检测H1～H16和N1～N9亚型的成套特异性引物和探针进行实时RT-PCR检测，以验证病毒亚型。
http://pic2.cmt.com.cn/WebImages/46193/46193_7256e7f8-5ceb-41e5-a573-6b2619f30953.jpg
（未完，待续）
有一个问题，想和大家讨论，报道的3例病人有两例继发了细菌感染，属于院感吗？个人认为不属于。大家怎么看。
还有，三例病人均使用了抗菌药物，全部合理吗？当然继发感染的必须使用抗菌药物！！ 一种新型禽源性甲型流感（H7N9）病毒感染人类（2）
基因组测序和系统发生分析
我们使用Qiagen OneStep逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）Kit、共采用了198套引物扩增全基因组进行测序。我们使用QIAquick Gel抽提试剂盒（Qiagen）从琼脂糖凝胶中对PCR产物进行提纯。我们使用ABI 3730xl自动DNA分析仪（Life Technologies）和ABI BigDye Terminator v3.1 循环测序试剂盒（Life Technologies），并按照制造商的建议完成了测序。2013年3月29日，将来自这些患者病毒的全基因组序列存入了全球共享禽流感数据倡议组织（GISAID）数据库中（补充附录中的表S1提供了登录号，可与本文的全文从NEJM.org获取）。
（点击看大图）
我们使用MEGA软件（5.05版）与ClustalW项目进行了多个序列排比。我们使用MEGA软件（5.05版）、通过临接法构建了系统发生树，对与来自GenBank的、经选择的甲型流感病毒株之间的病毒基因联系进行估计。
结果
患者
患者1是1例87岁患有慢性阻塞性肺疾病（COPD）和高血压的男性，他报告在疾病发作时有咳嗽和咳痰。患者在疾病发作后1周出现了高热和呼吸困难。患者在症状出现前2周内没有已知的活禽类暴露史。
患者2是1例以高热和咳嗽到医院就诊、有乙型肝炎病毒感染史（乙型肝炎表面抗原阳性）的27岁男性。该患者是1名在一名有活鸟类交易市场工作的肉贩。患者从事猪肉销售，但在疾病发作前未处理过禽肉。患者1和2均住在上海市闵行区，且均被收入（上海市）第五人民医院。
患者3是1例居住在安徽省的35岁妇女。她有抑郁、乙型肝炎病毒感染和肥胖史。患者3在疾病发作时也有高热和咳嗽。她在症状发作前1周到过鸡市场。表1（见上期）是3例患者人口统计学和流行病学特征的总结。
致病性病原体的确定
我们通过实时RT-PCR、病毒分离和全基因组测序的方法证实，所有3例患者均感染了一种新型禽源性甲型流感（H7N9）病毒。通过实时RT-PCR技术的分析，采集自所有3例患者的原始临床标本均被证实为H7N9阳性，而季节性流感病毒（H1、H3或B）、H5N1、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和人类冠状病毒（HCoV）-伊拉斯谟医学中心（EMC）阴性。从患者1、2和3中分别分离出了流感病毒A/上海/1/2013（H7N9）、A/上海/2/2013（H7N9）和A/安徽/1/2013（H7N9）。3株H7N9流感病毒的全长序列分析结果显示，在所有8个基因片段，它们的一致性达97.7%～100%（参见补充附录中的S1）。分离株所有基因的系统发生分析结果显示，每个基因均为禽源性（图1和补充附录中的图S1）。编码血凝素（HA）的基因与A/鸭/浙江/12/2011（H7N3，ZJ12亚型）的一致性最高。编码神经氨酸酶（NA）蛋白的基因与A/野鸟/韩国/A14/2011（H7N9，KO14）的相关性最密切。但是，来自我们3例患者H7N9病毒的HA基因与KO14病毒的HA基因差异很大。所有6个内部基因均与A/燕雀/北京/16/2012样病毒（H9N2）的相似性最大（图1）。系统发生结果表明它是一种三重重配的H7N9病毒（图2）。
在所有3株病毒中，HA剪切位点只有一个氨基酸R（精氨酸），表明对家禽的低致病作用。在所有3株病毒HA基因的150环（H3编号）处均辨别出了一个T160A突变。在A/安徽/1/2013及A/上海/2/2013病毒中均发现了HA基因210环的Q226L替代，但在A/上海/1/2013病毒中没有该替代（表2，见上期）。发现NA残基69～73茎部区域缺失了5个氨基酸。M2蛋白质有S31N替代，表明对金刚烷胺耐药。其他突变 （PB2中的89V和E627K和NS1中的42S）也得以辨别（表2）。A/上海/1/2013的氨基酸（与A/安徽/1/2013和A/上海/2/2013不同）见补充附录中的表S2。迄今为止，已从5例患者中分离出了另外5株H7N9病毒。测序分析结果表明，所有5株病毒均与A/上海/2/2013及A/安徽/1/2013高度相似。但也观察到一些变异，如HA中的Q226L和NA中的R292K。
根据这些数据，已经开发出了新型重配H7N9病毒的诊断性检测技术。特殊序列可从世界卫生组织网站上获得（www.who.int/influenza/gisrs_ laboratory/a_h7n9/en/）。
患者的临床特征和转归
患者的临床特征见补充附录中的表S3。发热和咳嗽是最常见的症状。白细胞计数为正常或轻微下降。所有患者均观察到了天冬氨酸氨基转移酶、肌酸激酶和乳酸脱氢酶水平的升高。胸部X线片发现有双侧毛玻璃样不透明影和实变影（图3）。
观察到了疾病的多种并发症。所有患者均有急性呼吸窘迫综合征（ARDS）。患者3有脓毒性休克和急性肾损伤。2例患者在开始机械通气后所采集的下呼吸道标本中培养出了对碳氢霉烯耐药的鲍氏不动杆菌。
所有3例患者均接受了抗生素联合治疗、糖皮质激素和静脉用免疫球蛋白的治疗。在疾病发作后6～7天，开始了抗病毒治疗（表1，见上期）。
患者1拒绝入住重症监护病房（ICU）和接受气管插管。他在疾病发作后13天死于顽固性低氧血症。患者2在入院后48小时由于进行性呼吸困难而入住ICU和接受气管插管，患者入住ICU 4天后死于顽固性低氧血症。患者3在疾病发作后第6天发生ARDS和脓毒性休克，她入住了ICU，并开始接受了体外膜氧合治疗，她于4月9日死亡。
讨论
我们辨别出了一种与严重人类感染相关的新型重配甲型流感（H7N9）病毒。目前，GenBank只有25株H7N9病毒。从3例患者中检出的H7N9病毒为禽源性，但是，仅NA基因与来自另一种H7N9病毒（KO14）的基因密切相关。在中国，HA基因与来自附近地区（浙江省）的H7N3病毒（ZJ12）基因相似。所有内部基因片段均与来自禽H9N2病毒、特别是一株从北京一只燕雀中分离的病毒（BJ16）密切相关（图1和补充附录中的图S1）。因此，人类H7N9病毒仅仅是禽源性病毒重配的产物。另外，系统发生树显示，从系统发生上看，A/上海/1/2013所有基因片段均不同于A/安徽/1/2013和A/上海/2/2013，这表明至少有两种途径引入到人类中（图1和补充附录中的图S1）。当前，尚无数据表明这种重配发生在哺乳动物宿主中，也无数据表明人类病毒与禽病毒的这种相似性可更强有力地支持这种病毒发生直接禽传播。但中国及其邻国很少进行鸟类、猪和人类的流感监测，因而解决该问题存在困难。
虽然以前已经观察到禽源性H7禽流感病毒的人类感染1，2，5，10，11，但是，以前尚无N9亚型流感病毒发生人类感染的报告。人类H7流感（病毒）的感染通常轻微，可引起结膜炎或最轻的呼吸道症状，虽然在这次H7N9暴发之前也报告了1例死亡病例5。（我们）在此报告的所有3例H7N9感染均是致命性的，患者的病情迅速恶化，发生了严重肺炎和ARDS，并最终引起死亡。所有患者之前均存在（基础）疾病，2例有家禽的直接接触史。2例患者发生了横纹肌溶解，而横纹肌溶解在感染H1N1或H5N112 流感病毒的患者中极少有报告。2例患者也观察到了脑病（脑病通常更多见于儿科流感患儿中）13。
流感病毒对不同唾液酸-糖结构的亲和力（大小）是病毒宿主范围和致病性的一个重要决定因素14，15。人类流感病毒优先与α2，6唾液酸聚糖结合，而大多数禽病毒与α2，3唾液酸聚糖结合16，17。预期HA蛋白质中的Q226L（最早在H7野外病毒以及H5亚型中报告）可强有力地与α-2，6人类样受体结合。已有研究显示，HA210环上的一种在实验室生成的Q226L突变可将与禽源性的受体结合改变****类型的受体结合，并可能会增加病毒经空气传播的能力（如以前的报告）18，19。另外，150环糖基化位点的缺失可能降低与α-2，3禽样受体的亲合力。这些突变的作用需要进一步的研究。
（我们）在新型重配H7N9病毒中观察到病毒NA茎部区域缺失了5个氨基酸。已有研究显示，H5N1禽病毒中的相似缺失可使病毒发生趋向呼吸道20或病毒复制增强21的改变，并且已有研究表明，这种缺失可能与（病毒）在家禽中的适应和传播相关22，23。自4月4日以来，已有报告显示，从鸽子和鸡中分离出了H7N9病毒，这种病毒与从本文所报告的3例患者中分离出的相似，表明新型H7N9病毒可能当前在家禽中循环。另外，PB2基因的E627K替代与（病毒）在小鼠中的毒力增加相关，并且有报告显示，该替代与禽流感病毒在哺乳动物中的复制增加相关24，25。这些替代的综合作用可能引起了人类感染和严重疾病。其他可能的毒力分子学标志物见表2（见上期）。可能的毒力突变是根据以前的动物研究进行描述的，但在人类中的发病机制尚不清楚。
两株上海病毒之间的差异和上海/2和安徽/1病毒之间的相似性不支持这些病例之间存在人对人的传播，并且在患者的密切接触者中，无一人这些病毒检测为阳性。但在2003年荷兰的H7暴发中，观察到了有限的人对人传播10。因此，不应低估这些新型禽源性病毒发生大范围流行的可能性。
当前尚无这些新型病毒的疫苗，目前也不清楚当前候选的H7疫苗病毒（其中3株为北美病毒，另3株为来自2000年荷兰的禽病毒）是否可能有效。流感H7N9 A/安徽/1/2013株已被提议作为候选疫苗株之一，因为它在鸡胚中可生长成极高的滴度。在处理这些病毒时，应采取强化保护措施，并且需要对这些病毒进行强化的监测和分析。
以高热和严重呼吸系统症状为特征的严重甲型禽流感（H7N9）感染可能构成一种严重的人类健康危险。我们因突发这些感染以及对人类群体的潜在危险而感到担忧。目前迫切需要了解这些感染的来源和传播方式、进一步的监测以及合适的应对措施。
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