结核分枝杆菌耐氨基糖苷类和多肽类抗结核药物分子机制的研究进展

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2012-12-20 13:41 来源：中华结核和呼吸杂志 作者：宋 艳华

氨基糖苷类药物链霉素、卡那霉素、阿米卡星和多肽类药物卷曲霉索是世界卫生组织推荐的注射用抗结核药物，卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素也是治疗耐多药结核病的核心二线药物。上述药物均作用于MTB核糖体，干扰细菌蛋白正常合成，在体外均有较强的杀菌活性，但上述药物之间存在交叉耐药现象，如选用不当可能导致治疗无效。现将MTB对上述药物的耐药机制，尤其是交叉耐药机制及其研究进展综述如下。

一、MTB耐氨基甙类和多肽类药物的分子机制

1.链霉素：链霉素是最早用于抗结核治疗的药物，多数链霉素耐药菌株的产生是由于核糖体蛋白S12的编码基因rpsL和（或）16SrRNA编码基因rrs突变所致，这两个基因突变株分别占链霉索耐药株的52%～59%和80%-21%。16SrRNA的530环是高度保守部分，它参与A位tRNA核糖体的译码过程，该区域突变常导致链霉素耐药；核糖体蛋白S12临近16SrRNA，对维持其稳定性较为重要，若S12蛋白突变，也导致链霉素耐药。最近有研究者发现.gidB基因突变与链霉素低度耐药相关，gidB编码的7-甲基鸟苷酸（m7G）甲基转移酶是一种rRNA甲基转移酶，其在MTB中的靶点是16SrRNA的530环中518位鸟苷酸（G），该位点是链霉素结合位点之一，518G甲基化对链霉素和16SrRNA结合有稳定作用，而gjdB突变使16SrRNA518G不能得到正常修饰，而引起链霉索耐药。33010的耐链霉素MTB菌株为gidB发生突变所致。

与链霉素耐药可能相关的rrs基因突变主要集中于16SrRNA的530环区和912区编码基因，与链霉素耐药相关的突变位点有492（C→T）、513（C→T）、514（A→ C/T）、517（C→T）和907（A→C）等，其中多为514和517位点突变。rpsL突变常发生于第43位和88位氨基酸密码子AAG→AGG（Lys-Arg）突变，其他突变类型有Lys43Thr和Lys88Thr/Gln/Met等，其中以43位密码子突变率较高。多数rpsL基因突变与菌株的链霉素高度耐药相关，rpsL基因突变株的耐药程度一般高于rrs突变菌株，但也有部分菌株rrs基因514或517位点突变与rpsL基因突变的MIC相同，而少数rrs突变株仍对链霉素敏感，这可能与各地区的流行菌株不同有关，也可能由其他机制或基因突变所致。

近年来有关于gidB基因突变与细菌耐链霉素相关性的报道，通过敲除H37Rv的gidB基因，证明gidB基因在链霉素低度耐药中的作用。在含链霉素的培养基中容易出现MTB的gidB基因突变，突变类型广泛，有点突变、缺失和插入等，变异部位也较分散，在敏感和耐药MTB临床菌株中均可发现gidB基因的多种突变形式，但尚不明确何种突变与链霉素耐药有显著相关性。有研究结果表明，链霉素对gidB突变菌株（不伴有rrs和rpsL基因突变）的MIC高于gidB未突变株的4倍，gidB基因突变不会导致卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素耐药，但易成为链霉素高度耐药株，且易合并rrs和rpsL基因突变。因此，检测到gidB基因突变菌株时，应考虑该菌株对链霉素的敏感度降低，且对链霉素有高度耐药的可能性，这有利于选择临床方案和调整药物剂量。

2.卡那霉素和阿米卡星：卡那霉素和阿米卡星耐药与16S rRNA编码基因rrs突变相关，编码氨基糖苷类乙酰转移酶的eis基因启动子区突变也可引起卡那霉素失活，导致其低水平耐药。rrs基因1401位A→G突变导致MTB高度耐卡那霉素和阿米卡星，在卡那霉素和（或）阿米卡星敏感菌株中未检出此突变，提示rrs基因A1401G突变是MTB对卡那霉素和阿米卡星交叉耐药的分子基础。卡那霉素、阿米卡星耐药菌株含有rrs基冈C517T和A514C突变，该突变可能导致链霉素与卡那霉索、阿米卡星交叉耐药，但也有C517T或A514C突变与阿米卡星和卡那霉素耐药无关的报道。上述研究结果不同的原因可能与各地区流行菌株的基因学差异及表型和基因型检测方法不同有关。eis基因启动子区最常见的是C-10A、C-14T突变，eis基因突变仅导致卡那霉素低度耐药，对阿米卡星无影响，也不引起链霉素和卷曲霉索交叉耐药。

3.卷曲霉素：虽然卷曲霉索属于多肽类药物，但其作用机制与氨基糖苷类药物相似。卷曲霉素的分子学耐药机制是tlyA和rrs基因发生突变，tlyA基因编码1种甲基转移酶的甲基化作用，可增强卷曲霉索的抗菌作用，此基因变异可导致卷曲霉素耐药。tlyA基因突变主要存在于实验室中暴露于卷曲霉素的耐药菌株中，而在临床耐药菌株中很少发生，其原因可能与临床使用卷曲霉素治疗结核病的时问相对较短，tlyA突变株数量较少有关。实验室研究结果表明，tlyA基因突变不会引起卡那霉素、阿米卡星耐药，但可引起卷曲霉素和紫霉素交叉耐药。与卷曲霉素耐药相关的r基凶突变有A1401G、C1402T和G1484T等位点突变，临床菌株中以A1401C突变最常见，且这种突变菌株多数对卷曲霉素呈低度至中度耐药，部分菌株对卷曲霉素仍敏感。卷曲霉素对部分含有A1401C突变的敏感菌株MIC值高于多数野生型敏感菌株，因此A1401G突变是卡那霉素和阿米卡星与卷曲霉素部分交叉耐药的分子基础。rrs基因C1402T和G1484T位点突变均可导致MTB对卷曲霉素高度耐药。G1484T突变导致卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素和紫霉素同时耐药，C1402T突变与卡那霉素、卷曲霉素和紫霉素交叉耐药有关。

二、氨基糖苷类药物耐药的分子诊断技术

目前用于耐药基因突变检测的分子生物学方法有DNA测序、PCR-单链构象多态性分析、PCR-限制性片段长度多态性分析、变性高效液相色谱技术和基因芯片等，但其临床应用的关键是寻找与耐药密切相关的耐药基因位点。MTB与氨基糖苷类药物耐药相关且灵敏度和特异度较高的基因位点：（1）rpsL基因43和88密码子：该位点突变可导致对链霉素高度耐药；（2）rrs基因1401位点：该位点突变可导致阿米卡星和卡那霉素同时高度耐药，采用测序法检测该基因突变对卡那霉素和阿米卡星耐药的特异度为100%.敏感度分别为85. 9%和92. 4% ，检测卷曲霉素耐药的敏感度和特异度分别为49. 3%和88. 6%，rrs基因联合tlyA基因检测可提高检测卷曲霉素耐药的敏感度。

临床菌株也存在表型和基因型不一致的情况，在某些耐药菌株（尤其是低度耐药菌株）中未能发现耐药基因，其原因与各地区MTB治疗史和流行菌株等不同有关，也与分子诊断技术的局限性有关。分子诊断方法对大多数临床菌株都敏感，当标本DNA量少或存在抑制PCR的物质时可出现假阴性，导致基因检测失败。尽管存在上述问题，分子诊断技术仍是临床检测氨基糖苷类药物耐药菌株的重要检测方法。

三、MTB临床分离株耐氨基苷类和多肽类药物的特点

氨基糖苷类药物之间，以及与多肽类药物之间有着相同的耐药基因，易产生完全或部分交叉耐药。实验室研究结果表明，卡那霉素和阿米卡星存在高度交叉耐药，仅少部分卡那霉素低度耐药菌株对阿米卡星敏感，而阿米卡星耐药菌株对卡那霉素基本全部耐药，卡那霉素和阿米卡星同时高度耐药菌株对卷曲霉素多为低度耐药，卷曲霉素耐药菌株对卡那霉素和阿米卡星可敏感，这3种药物交叉耐药的机制主要与rrs基因A1401G突变相关。链霉素与上述药物不存在交叉耐药性。临床菌株对上述4种药物的耐药关系与实验室研究结果不同。

链霉素在我国一线抗结核药物中的耐药率最高，其次是异烟肼，卡那霉素的耐药率较低。对链霉素耐药的菌株仍对卡那霉素、阿米卡星和卷曲霉素敏感，但耐卡那霉索（阿米卡星）或卷曲霉素的菌株基本对链霉素耐药；卡那霉素的耐药率与阿米卡星相近，卷曲霉素的耐药率略低于阿米卡星和卡那霉素，卷曲霉素耐药菌株对阿米卡星和卡那霉索基本都耐药。自从将乙胺丁醇用于初治结核病患者的短程化疗后，链霉素已不再是常规一线抗结核药物，但其耐药率并未下降。卡那霉素因其严重不良反应而逐渐被阿米卡星取代，卷曲霉素因其价格昂贵而限制其广泛应用，目前我国临床应用最广泛的治疗耐多药结核病药物为阿米卡星注射剂，而对阿米卡星耐药、卷曲霉素敏感或阿米卡星疗效不佳的患者，则采用卷曲霉素治疗。大量使用阿米卡星可能导致与卷曲霉素的交叉耐药率升高，但日前尚未见阿米卡星导致链霉素耐药率升高的证据。临床医生应结合患者所在地区的MTB耐药流行病学调查结果及患者用药史，结合药敏试验结果制定合理的抗结核药物治疗方案，以促进患者早日康复，避免产生耐药。

编辑： 雨声