微生物的接种、分离和培养

细菌耐药

微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必需从中把它们分离出来。在保存菌种时不慎受到到污染也需予以分纯。微生物分离和纯化的方法很多，但基本原理却是相似的，即将待分离的样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞（或孢子）尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。然而上述工作又离不开接种，即将一种微生物移到另一灭过菌的培养基上的过程。

细菌耐药

（一）接种的操作

1、斜面接种（接金黄葡萄球菌）

（1）操作前，先用75%酒精擦手，待酒精挥发后点燃酒精灯。

（2）将菌种管和斜面握在左手大姆指和其它四指之间，使斜面和有菌种的一面向上，并处于水平位置。

（3）先将菌种和斜面的棉塞旋转一下，以便接种时便于拔出。

（4）左手拿接种环（如握钢笔一样），以火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。

（5）用右手的无名指、小指和手掌将菌种管和待接斜面试管的棉花塞或试管帽同时拔出，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧过烫）。

（6）将灼烧过的接种环伸入菌种管内，接种环在试管内壁或未长菌苔的培养基上接触一下，让其充分冷却，然后轻轻刮取少许菌苔，再从菌种管内抽出接种环。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。。

（7）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面底部向上作“Z”形来回密集划线。有时也可用接种针仅在培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。

（8）接种完毕后抽出接种环灼烧管口，塞上棉塞。

（9）将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。

2、液体接种

（1）由斜面培养基接入液体培养基，此法用于观察细菌的生长特性和生化反应的测定，操作方法与前相同，但使试管口向上斜，以免培养液流出接入菌体后，使接种环和管内壁磨擦几下以利洗下环上菌体。接种后塞好棉塞将试管在手掌中轻轻敲打，使菌体充分分散。

（2）由液体培养基接种液体培养基，菌种是液体时，接处除用接种环外尚用无菌吸管或滴管。接种时只需在火焰旁拔出棉塞,将管口通过火焰,用无菌吸管吸取菌液注入培养液内,摇匀即可。

3、平板接种

将菌在平板上划线和涂布。

（1）划线接种 见分离划线法。

（2）涂布接种 用无菌吸管吸取菌液注入平板后，用灭菌的玻棒在平板表面作均匀涂布。

4、穿刺接种

把菌种接种到固体深层培养基中，此法用于嫌气性细菌接种或为鉴定细菌时观察生理性能用。

（1）操作方法与上述相同，但所用的接种针应挺直。

（2）将接种针自培养基中心刺入，直刺到接近管底，但勿穿透，然后尚原穿刺途径慢慢拔出。

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（二）分离的操作方法

1、稀释分离法

通过不断稀释使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板与温度适合溶化了的琼脂培养基混合，这样分散的细菌被固定在原处而形成单菌落。

（1）将大肠杆菌或酵母菌用无菌水制作菌悬液。

（2）取若干支无菌试管，每支内盛9ml无菌水。

（3）吸取1ml制备好的菌悬液，置于第一支含有9ml无菌水的试管内，这样就稀释了10倍，也就是10-2。

（4）从第一支试管内（10-2）吸取1ml注入第二支含有无菌水的试管内，这样就稀释了100倍，也就是10-2。

（5）用同样方法操作，直至稀释至10-5-10-6。

（6）分别精确吸取10-5-10-6各稀释度菌液0.2ml加入编好号的空无菌平皿中，同一稀释度重复做三个平皿。

（7）将已溶化并冷却至45℃的琼脂培养基倒入上述各平皿内，轻轻旋转使培养基与菌悬液充分混匀，凝固后倒置于37℃或38℃度恒温箱中培养24-48小时，观察平板上菌落生长和分布情况。

2、平板划线分离法

平板划线分离法是接种环在平板培养基表面通过分区划线而达到分离微生物的一种方法。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。

（1）倒平板 溶化牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板，水平静置待凝。

（2）在酒精灯光焰上灼烧接种环，待冷，取一接种环金黄葡萄球菌、大肠杆菌混合菌液。

（3）左手握琼脂平板稍抬起皿盖，同时靠近火焰周围，右手持接种环伸入皿内，在平板上一个区域作之形回划线，划线时例接种环与平板表面成30-40°角度轻轻接触，以腕力在表面作轻快的滑动，勿使平板表面划破或嵌进增基内。

（4）灼烧接种杯，以杀灭接种环上尚残余的菌液，待冷却后，再将接种环伸入皿内，在第一区域划过线的地方稍接触一下后，转动90°，在第二区域继续划线。

（5）划毕后再灼烧接种杯，冷却后用同样方法在其他区域划线。

（6）全部划线完毕后，在平皿底用特种蜡笔注明菌种、日期、组别、姓名。将整个培养皿倒置放入恒温箱培养。

（7）37℃经过24-48小时培养后取出观察。注意菌落的开关、大小、颜色、边缘、表面结构、透明度等性状。

细菌耐药

无菌操作环节

（1）接种室应保持清洁，用煤粉酚皂液擦洗台面及墙壁，定期用乳酸或甲醛熏蒸。每次使用前，均应用紫外灯灭菌。定期对接种室作无菌程度的检查。

（2）进入接种室前，应先做好个人卫生工作，在缓冲间内要更换工作鞋帽、工作衣、戴口罩。工作衣、工作鞋、口罩只准在接种室内使用。不准穿到其它地方去，并要定期更换、消毒。

（3）接种的试管、三角并瓶等应做好标记，注明培养基、菌种的名称、日期。移入接种室内的所有物品，均须在缓冲室用70%酒精擦试干净。

（4）接种前，双手用70%酒精或新洁尔消毒，操作过程不离开酒精灯火焰；棉塞不乱放；接种工具使用前后均需火焰灭菌。

（5）培养箱应经常清洁消毒。

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正需要这方面的知识，非常感谢楼上老师，已经认真学习了

xmxxcx

路过学习了！谢谢老师的奉献！！

沧海一声笑

很规范啊，堪称SOP了！

玉蝶

院感人应该掌握的知识，谢谢老师。

珠城天使

我院各种监测培养均由检验科完成，所以对微生物的接种分离等方面的知识可谓一窍不通。请教老师，临床送检的痰培养标本是否都应先经筛选？

细菌耐药

珠城天使 发表于 2012-10-14 21:53

                               
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我院各种监测培养均由检验科完成，所以对微生物的接种分离等方面的知识可谓一窍不通。请教老师，临床送检的 ...

是的，符合样品采集要求的痰标本才应进行培养。

不过，为防止与临床发生矛盾，直接退标本，医生们往往难以接受。我们的做法是：进行痰涂片判读标本是否合格。

紫色的云儿

首先盛痰容器必须清洁；患者在留标本前，应先漱口，然后用力自气管深部咳出痰液，吐入痰器中，采样后立即送检。采集标本前数小时，不可用消毒药物漱口。对于痰量少或无痰的患者，可采用雾化吸入加温至45度的10%氯化钠水溶液，使痰易于咳出。对于痰量较少的小儿，可轻轻压迫胸骨上部的气管，使其咳嗽。微生物室收到标本先涂片，合格的痰培养标本：鳞状上皮细胞＜10个/LP、中性粒细胞＞25个/LP。

lqxm

微生物真的不是一般的难学！

珠城天使

我问过我们检验科微生物室的工作人员，他们对临床送来的痰培养标本向来都是直接做培养的，我现在也知道了标本应先进行筛选，但不知该如何跟他们沟通？我们的检验科主任是博士，可微生物室的工作人员只是大专生，每次和主任说到微生物室相关工作如统计细菌耐药率等，他都只说你去找微生物室工作人员，有时候，我觉得自己完全是个门外汉，跟他们沟通是不是班门弄斧？

紫色的云儿

珠城天使 发表于 2012-10-15 12:41

                               
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我问过我们检验科微生物室的工作人员，他们对临床送来的痰培养标本向来都是直接做培养的，我现在也知道了标 ...

你们检验科主任能是博士的话，你们医院的等级也不低的，微生物室应该是用仪器的，那微生物系统里面有统计细菌耐药率或者细菌敏感率的，你让他们看看，把相关参数输入就可以了

珠城天使

听她们的语气，好像还是手工统计的，有时间和他们认真沟通一下