儿童肺炎链球菌性疾病诊断及治疗

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1. 病原学
肺炎链球菌为链球菌属细菌，革兰染色阳性，菌体呈矛头状，常以钝端相对、尖端向外成双排列，细胞外壁有荚膜。该菌对温度抵抗力较弱，52～56℃加热15～20分钟即被灭活。对化学消毒剂均很敏感，含氯消毒剂如氯胺、二氯异氰尿酸钠水剂5分钟内可灭活。对干燥的抵抗力较强，在干燥的痰液中可生存数月。
荚膜的多糖抗原是肺炎链球菌毒力的必须条件，也是分群和分型的基础。感染肺炎链球菌或接种疫苗后，机体可产生针对荚膜多糖的抗体，从而起到预防的作用。Neufeld在1902建立荚膜肿胀实验（quellung reaction），根据多糖成分的不同将肺炎链球菌分为90多个血清型。肺炎链球菌血清型分布因调查的时间、区域和研究人群的不同而异。全球各年龄组80％以上的侵袭性肺炎链球菌疾病（invasive pneumococcal diseases，IPDs）与20-30个血清型有关。
肺炎链球菌广泛分布于自然界，人类是其唯一宿主。肺炎链球菌可定植于正常人的鼻咽部，在儿童鼻咽部定植的比率尤其高，我国5岁以下健康或上呼吸道感染儿童中，鼻咽拭子肺炎链球菌分离率可达20%~40% 。导致感染的肺炎链球菌，其主要血清型与鼻咽部定植菌的血清型往往一致。肺炎链球菌通过呼吸道飞沫传播或由定植菌导致自体感染。细菌可局部播散到鼻窦或中耳导致感染，吸入下呼吸道导致肺炎，当细菌侵入血液循环，伴或不伴其他部位的播散繁殖，则可引起侵袭性感染。
2. 肺炎链球菌 性疾病 的类型和流行病学
肺炎链球菌可引起非侵袭性疾病，主要包括扁桃体咽炎、中耳炎、鼻窦炎和非菌血症性肺炎等，也可以引起严重的侵袭性疾病。所谓侵袭性疾病是指肺炎链球菌侵入与外环境无直接相通的、原本无菌的部位和组织引致感染，包括脑膜炎、菌血症、脓毒症、菌血症性肺炎以及脓胸、心包炎、心内膜炎、腹膜炎和化脓性骨关节炎等。
WHO 2005年估计，全球每年约有70-100万5岁以下儿童死于PDs，这些儿童大多数生活在发展中国家，2岁以下儿童的死亡率尤其高。PDs是导致全球5岁以下儿童死亡的首位病因，占疫苗可预防疾病致死数的28%，远远超过b型流感嗜血杆菌疾病（15%）等病因。肺炎链球菌性脑膜炎的幸存者中常可见到造成终身残疾的后遗症，发生概率高于流感嗜血杆菌和脑膜炎双球菌。美国1998年的数据显示，IPDs在12月龄以下婴儿和12-23月龄幼儿的发病率分别为165/10万和203/10万，而整体人群的发病率为24/10万。除IPDs外，肺炎链球菌还是儿童社区获得性肺炎的首位病原菌，重症肺炎中肺炎链球菌的比例约为50%，而在致死性肺炎中比例可能更高。其沉重的疾病负担使得WHO将预防PDs作为发达国家和发展中国家的重点工作，并将PDs列为最高优先使用疫苗预防的感染性疾病。
目前为止，我国有关儿童肺炎链球菌疾病的流行病学数据较少。WHO认为发展中国家5岁以下儿童IPDs的发病率远比工业化国家高。上世纪90年代初，在合肥的研究表明5岁以下儿童肺炎链球菌脑膜炎的发生率为1.5/10万，而对菌血症等其他IPDs缺乏调查研究。上述报告的发病率低于发达国家的发病率，取样的困难程度、抗生素的广泛使用和实验室的检测能力等均影响了肺炎链球菌的检出率。1996~2000年全国5岁以下儿童死亡监测结果分析，肺炎是我国5岁以下儿童死亡的首位原因（773/10万），占全部死亡的19%。最近GAVi PneumoADIP的研究估计了全球5岁以下儿童PDs的疾病负担，并估算中国每年有174万人，死亡人数为3万人。肺炎链球菌的血清型分布也是流行病学数据的重要组成部分。近期对住院肺炎患儿的调查显示，常见的血清型为19F (60.6%)、19A (9.7%)、23F (9.3%)和6B (5.4%)，7价疫苗覆盖率平均为81.0%，流行病学研究表明耐药菌株集中于常见血清型，PNSP中以19F、19A、23F和6B型多见。
PDs的发病率，死亡率，血清型分布和连续监测是免疫决策的基本信息。目前，大多数国家包括中国尚未建立对PDs的系统监测网络，临床和实验室诊断也未采用统一标准，抗生素广泛使用影响了肺炎链球菌的检出率。因此，对PDs开展系统的流行病学研究极其重要，其将为政府免疫规划决策部门提供参考依据。

3.肺炎链球菌的实验室诊断

肺炎链球菌的病原学诊断相对困难，有以下几个原因：1）抗生素的广泛使用可以使其分离率大大降低；2)非侵袭性疾病不伴有菌血症，血液培养难有阳性结果；3）因为肺炎链球菌常在上呼吸道定植，呼吸道标本的细菌培养结果会受到干扰。深部呼吸道标本的细菌培养可以确诊，却需要侵入性操作，如肺穿刺等，通常患儿的家长难以接受。需要对肺炎链球菌的病原学诊断统一标准，对其进行系统和连续监测，为制定防治策略提供依据。
3.1 肺炎链球菌的传统分离、培养和鉴定方法
（1）标本的取材：采集患者感染部位标本进行包括细菌涂片和培养的病原学诊断。标本采集最好在使用抗菌药物前进行，根据感染部位的不同采集血液、脑脊液、关节液、脓液、痰液等。
脑脊液的细菌培养在脑膜炎的诊断中起到十分重要的作用。使用抗菌药物之前采集1-2ml脑脊液进行微生物学检测（包括涂片和培养）。脑脊液标本在常温下应在15分钟内送达实验室，不可放置冰箱保存。通常脑脊液标本需要血清肉汤增菌后再进行分离培养，如有全自动血培养仪，则可以将脑脊液、关节液等无菌体液直接注入全自动化血培养瓶中进行检测。建议作脑脊液培养时同时作血培养。
血培养阳性对患者的诊断和预后有重要的意义。理想的采血时间是发热高峰前1小时内或开始时；使用抗菌药物之前采集血液。为提高细菌的检出的阳性率应该同时做需氧和厌氧培养。对于全自动血培养仪，成人采血量为每瓶8-10ml；儿童使用儿童专用培养瓶，采血量为1-5ml；婴幼儿采血量不能超过总血量的1%。血液采集结束后应该立即运送到微生物实验室，若无法立即运送到实验室，可以短期内将标本在室温保存，保存时间不可大于12小时，血培养瓶不能冷藏。
痰液标本是最常获取的呼吸道标本，同时也是最容易污染的标本。痰液应该于清晨采集，成人、年长儿采集前嘱其漱口，清除口腔和鼻腔内的分泌物，深呼吸将痰液用力咳出，咳出的痰液用无菌小瓶盛放，并尽快送检。痰标本应进行涂片以评估标本的质量，合格的痰标本应含白细胞、脓细胞或支气管柱状上皮细胞较多，而受污染的痰标本则以扁平麟状上皮细胞为主。以白细胞>25个，鳞状上皮细胞<10个/低倍视野为合格标本。粘稠的痰应当液化使其均质化后再接种。
（2）涂片镜检：脑脊液等无菌体液标本离心后取沉淀进行涂片和革兰染色，阳性报警的血培养瓶可取出少量内容物直接涂片和染色。显微镜下肺炎链球菌是直径小于2μm的革兰阳性球菌，成对排列，矛尖状，宽端相对，尖端向外，无芽孢，无动力，部分菌株直接涂片可看到荚膜。
（3）肺炎链球菌的培养和鉴定：兼性厌氧，5%～10%的CO2有利于其生长。肺炎链球菌对营养要求高，在血平板（如5%脱纤维羊血的哥伦比亚琼脂）上生长良好，最适宜的生长温度为35±2℃，生长18～24h后在血平板上形成灰白色，透明或半透明，表面光滑的小菌落，个别可产生黏液使菌落变得大而湿润，在菌落的周围出现草绿色溶血。
Optochin试验：Optochin（奥普托辛，乙基氢化羟基奎宁，ethylhydrocupreine）能干扰肺炎链球菌叶酸合成，抑制该细菌生长，故肺炎链球菌对奥普托辛敏感，而其他链球菌则对其耐药。将含量为5μg的奥普托辛纸片贴于涂布有疑似菌落的血平板上，置于5%～10%的CO2，35±2℃的孵育18～24h后，观察奥普托辛纸片周围的抑菌环。如果纸片周围的抑菌环直径≧14mm，可判定为肺炎链球菌；如抑菌环直径<14mm，则需要结合胆汁溶菌试验、乳胶凝集试验、其他数码鉴定系统综合判断。
胆汁溶菌试验：肺炎链球菌可以产生自溶酶，培养时间长的肺炎链球菌中央会出现凹陷，就是自溶酶的自溶作用的结果。用含有2%的脱氧胆酸钠溶液活化肺炎链球菌的自溶酶，促进细菌细胞被破坏从而使菌体裂解自溶，这一特性可用于肺炎链球菌的鉴定。试验时用接种环取2%的去氧胆酸钠溶液，滴加到被检测细菌的菌落上，35℃孵育30min后观察结果，如果菌落消失则为阳性，菌落未消失则为阴性。
乳胶凝集试验：原理是利用肺炎链球菌荚膜的抗原性，用覆盖了所有肺炎链球菌血清型的抗体来致敏乳胶颗粒。有肺炎链球菌存在时，其荚膜上的抗原和乳胶颗粒上的抗体可发生抗原抗体反应，产生肉眼可见的乳胶颗粒凝集现象。此法可以快速鉴定肺炎链球菌。乳胶凝集法的局限性在于如果检测的细菌数量较少，会出现假阴性结果，需要传种以获得足够量的菌；有些C群链球菌可能发生假阳性反应。
实验室其他鉴定方法还包括API20 Strep试剂条、全自动数码鉴定系统，这些方法可以用于高度怀疑肺炎链球菌感染、奥普托辛和胆汁溶菌试验不典型的菌株的鉴定。此外还可利用分子生物学技术如16SrDNA等进行鉴定。
（4）体外药敏试验：临床常用的药敏试验包括纸片扩散法、微量稀释法（自动化仪器）、琼脂稀释法和Etest法。肺炎链球菌纸片扩散法采用加有5%羊血的MH琼脂，检测的药物包括万古霉素、复方磺胺甲噁唑、红霉素、克林霉素、氯霉素、四环素等。青霉素的药物敏感性需用含有1ug的苯唑西林纸片来检测，当苯唑西林抑菌圈≥20mm，应报告对青霉素（MIC≤0.06 μg/ml）敏感；如果抑菌圈直径≤19 mm，则需要测定青霉素的MIC。
对于非脑膜炎分离株，当青霉素MIC≤0.06μg/ml （或苯唑西林抑菌圈≥20mm），则提示该菌株对阿莫西林（口服或静脉）、头孢克洛、头孢托仑、头孢地尼、头孢丙烯、头孢泊肟、头孢唑肟、头孢噻肟、头孢呋辛、亚胺培南和美罗培南等敏感。对于脑脊液分离株，应当用可靠的方法确定青霉素、头孢噻肟、头孢曲松和美罗培南的最低抑菌浓度（MIC），万古霉素的敏感性可以使用MIC法或纸片扩散法来确定。
3.2 肺炎链球菌的血清分型方法
SP血清分型的经典方法为荚膜肿胀试验（quellung reaction），即用型特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合，可使细菌荚膜显著增大出现肿胀，这种变化可在显微镜下观察。荚膜肿胀试验操作较复杂，全套试剂昂贵，显微镜下的形态观察存在一定的主观性。最近开发的SP的血清乳胶凝集试验（如Pneumotest-Latex试剂盒），操作简单，结果便于观察。此法的原理是用群/型特异抗血清致敏乳胶颗粒，当遇到特异SP荚膜抗原时，因抗原抗体反应而产生肉眼可见的乳胶聚集现象，从而鉴别血清群/型。但此方法仅覆盖23-价疫苗包括的血清群；对于某些特异血清型的鉴定，还需要需采用荚膜肿胀试验进一步分型。随着分子生物学技术的发展，采用多重PCR及反向线点杂交（RLB）等方法进行血清分型技术，均显示良好应用前景。
3.3 其它非培养的诊断技术
包括免疫层析法（ICT）、酶联免疫吸附法（ELISA）、乳胶凝集法、聚合酶链反应（PCR）等分子诊断技术
4 . 肺炎链球菌性疾病的治疗
4.1 肺炎链球菌的抗生素耐药
自1967年Hansman和Bullen首次分离到青霉素不敏感肺炎链球菌（PNSP）以来，肺炎链球菌的常用抗生素耐药已变成全球性的问题。亚历山大项目（Alexander project）显示：1992年至2001年间，青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）在美国从5.6%上升至20.4%，在欧洲则增加了8.1%。目前肺炎链球菌耐药最严重的地区和国家就在东亚和东南亚，根据亚洲耐药病原菌监测网（ANSORP）2004年的报告， PNSP高达52.4%。我国的情况也很严峻，2006-2008年我国四家儿童医院开展的住院肺炎流行病学研究发现，PNSP已达86.0%。儿童的情况尤其要引起重视，2007年全国CHINET链球菌属耐药监测资料显示：成人PNSP为26.4%，而儿童PNSP高达88.5%，儿童鼻咽部成为PRSP的主要储存库。肺炎链球菌交叉耐药和多重耐药现象明显，PNSP对红霉素耐药率为91.3%-100%，且为高水平耐药，MIC≥256 mg/L。
2008年美国临床和实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）修订了肺炎链球菌青霉素折点判定标准，口服青霉素沿用原先标准，即 S≤0.06mg/L，I 0.12～1mg/L，R≥2mg/L；而对胃肠道外使用青霉素的折点标准是：脑膜炎标本（脑脊液）来源菌株S≤0.06mg/L，R≥0.12mg/L，非脑膜炎标本（呼吸道，血流）来源菌株S≤2mg/L，I 4mg/L ，R≥8mg/L。不难发现，与原标准对照，对非脑膜炎标本来源的菌株，新折点标准有大幅提高，导致青霉素对肺炎链球菌的敏感率大幅度提高。CLSI本意是希望临床医生不应忽视病人实际情况，过分注意MIC值、并在初始治疗就选用广谱抗菌药物。我们不能因此而认为PNSP不是一个值得担忧的问题，而是要对PNSP作密切的动态监测，以发现其流行状况的变化趋势。
4.2 抗菌药物的选择
4.2.1 侵袭性肺炎链球菌性疾病
对肺炎链球菌引起IPDs患者，疑似肺炎链球菌脑膜炎或其它细菌性脑膜炎的所有儿童（包括新生儿），初始经验治疗应使用万古霉素联合头孢噻肟或头孢曲松。如对β-内酰胺类（青霉素和头孢菌素）过敏者，可考虑万古霉素和利福平联合给药。可供选择以治疗肺炎链球菌脑膜炎的其它抗菌药物包括美洛培南或氯霉素（谨慎使用！）。一旦获取脑脊液培养和药敏结果，则应据此调整抗菌药物。如果对青霉素、头孢噻肟或头孢曲松敏感，则应停止万古霉素的继续使用，只有当肺炎链球菌对青霉素和头孢噻肟或头孢曲松不敏感时，才应该继续使用万古霉素。

婴儿和儿童IPDs静脉抗菌药物的推荐剂量和用法如下表：

抗菌药物	肺炎链球菌脑膜炎		非脑膜炎 IPDs
	剂量 /(kg.d)	间隔时间（ hr ）	剂量 /(kg.d)	间隔时间（ hr ）
青霉素G	25万-40万U	4-6	25万-40万U	4-6
头孢噻肟	225-300mg	8	75-100mg	8
头孢曲松	100mg	12-24	50-75mg	12-24
万古霉素	60mg	6	40-45mg	6-8
利福平	20mg	12	无指征使用	无指征使用
氯霉素	75-100mg	6	75-100mg	6
氯林可霉素	无指征使用	无指征使用	25-40mg	6-8
美洛培南	120mg	8	60mg	8
亚胺培南	无指征使用	无指征使用	60mg	6
利奈唑胺	无指征使用	无指征使用	30mg	8

说明：1.本表适用于28天以上婴幼儿和儿童；

2.利福平不宜单独使用，适用于对β-内酰胺类抗生素严重过敏的PSSP脑膜炎者。对PNSP脑膜炎者，有报道与头孢曲松/头孢噻肟和/或联合万古霉素治疗成功的病例；

3. 氯霉素注射剂，美国儿科学会（AAP）批准可用于3月龄以上婴幼儿和儿童PSSP脑膜炎，对PNSP脑膜炎并不推荐，因为届时细菌虽可被抑制，但不能被杀灭；

4. 美洛培南被FDA推荐用于3个月龄及以上婴儿，其引起癫痫危险性远低于亚胺培南。单独或联合治疗PNSP脑膜炎、万古霉素不能耐受者；

5. 亚胺培南仅限用于肺炎链球菌多重耐药、非脑膜炎IPDs患儿，表中剂量适用于<12岁儿童，≥12岁儿童的剂量为20mg/kg.d（分2剂注射），注意该药有导致癫痫的风险，故肺炎链球菌脑膜炎无使用指征；

6. 对危重的免疫功能受损的非脑膜炎IPDs患者，初始治疗就可参照肺炎链球菌脑膜炎方案，即万古霉素或利奈唑胺联合头孢噻肟或头孢曲松治疗。对于既往健康、非危重病例、非脑膜炎的IPDs患儿，初始抗菌药物治疗按通常推荐的剂量（参见上表所示），选择青霉素或头孢噻肟或头孢曲松，而后再根据治疗反应和细菌培养与药敏调整药物，如果对青霉素、头孢噻肟或头孢曲松不敏感，则可选择万古霉素、利奈唑胺等。

4.2.2 非侵袭性肺炎链球菌性疾病
4.2.2.1 非菌血症性肺炎
轻度肺炎可在门诊口服抗菌药物治疗，首选口服阿莫西林，剂量加大至80～90mg/(kg·d)，也可选择阿莫西林/克拉维酸（7:1剂型）、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢丙烯、头孢地尼等。我国肺炎链球菌对大环内酯类抗菌药物高度耐药，克拉霉素、阿奇霉素只作为替代选择。重度肺炎应该住院治疗，初始经验治疗选择静脉途径给药。要考虑肺炎链球菌耐药，但以PISP为主，由此我们可以首选阿莫西林/克拉维酸（5:1）或氨苄西林/舒巴坦（2:1），或头孢呋辛或头孢曲松或头孢噻肟。对危重者宜使用头孢曲松或头孢噻肟联合大环内酯类，特别在治疗初始48~72小时。万古霉素和利奈唑胺不宜作为首选
4.2.2.2 中耳炎

直至近年，美国儿科学会（AAP）、美国家庭医师协会（AAFP）依然认为：对疑似AOM、早期轻症AOM、无免疫缺陷的患儿可以临床严密观察、随访等待而暂不使用抗菌药物。有指征使用者首选青霉素或阿莫西林（80～90mg /kg·d）口服，对初始治疗3天、临床确认治疗失败者，替代抗菌药有口服阿莫西林+克拉维酸（7：1剂型）、头孢呋辛、头孢泊肟酯、头孢地尼等。青霉素过敏者选用大环内酯类，常用的有红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素。考虑PNSP性中耳炎，或呕吐难以口服抗菌药物者、持续性中耳炎者宜选择头孢曲松肌肉注射。无并发症的AOM患者抗菌药物疗程7d～10d（头孢曲松肌注仅需1d~3d），对鼓膜穿孔者和2岁以下年幼儿疗程常需适当延长。对多重耐药的肺炎链球菌，应与感染性疾病专家进行会诊后再考虑使用氯林可霉素、利福平或其它抗菌药物。复发性急性中耳炎（RAOM）有预防使用抗菌药物的指征，可以选用阿莫西林或氯林可霉素。外科治疗对RAOM有时是必需的，例如鼓膜切开术并植入通气管等。

4.2.2.3 鼻窦炎

保证鼻窦分泌物引流通畅是治疗关键。肺炎链球菌致细菌性鼻窦炎，抗菌药物选择类同肺炎链球菌急性中耳炎，首选青霉素、阿莫西林等。复发性细菌性鼻窦炎的急性发作期或治疗3 天临床无好转者，应选用对β-内酰胺酶稳定的青霉素类或头孢菌素类抗生素，疗程可以延长至3-4周。

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