耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测和分型方法（1）

胡杨

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的检测和分型方法研究进展
廖方、范昕建（华西医科大学附属第一医院 传染内科，成都）
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methcillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)引起的院内感染(nosocomial infection)已经成为全世界一个越来越严重的问题。要想尽快获得MRSA的相关信息从而采取适当的控制感染的措施，就必须依靠快速、可靠的检测和分型方法。由于MRSA对甲氧西林耐药性的不断变化，故虽然目前存在检测和分型方法很多，但仍很难提供一种最优方法。在这里，我们对多种方法进行了比较，以便大家能从中选出既准确又省时且适合自己实验室使用的检测的分型方法。
1　检测方法
1.1　完整结构水平
1.1.1琼脂平皿2倍稀释法和肉汤微量稀释法　这两种方法是美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的方法。琼脂平皿2倍稀释法和肉汤微量稀释法所需要的培养基中分别含4%和2%的NaCl，PH为7.0，在30～35℃下培养24h。对于甲氧西林，MIC≥16mg/L为耐药；实验中，一般用较稳定的苯唑西林代替甲氧西林，其MIC≥4mg/L为耐药。NCCLS把琼脂平皿2倍稀释法作为“金标准”，其他方法与之比较，从而判定其检测MRSA的敏感及特异性。
1.1.2　平板扩散法　把0.1ml的菌液(0.5麦氏单位)均匀涂布在含4%NaCl、6mg/l苯唑西林(或10mg/l甲氧西林)的MH琼脂表面，在35℃下培养24～48h后，观察结果。Coudron等报告，使用此方法，MRSA的检出率为91%～94%。若菌液接种在不含NaCl的MH琼脂上，经24～48h孵育后，MRSA的检出率为87%～89%。Richard等报告，扩散平板法检测MRSA的敏感性和特异性均为100%，可作为临床微生物实验室的常规方法［1］。
1.1.3　纸片扩散法 (K～B)　Coudron等采用5mg/L和10mg/L的甲氧西林药敏纸片，培养基采用含4%NaCl和不含NaCl的MH琼脂。检测结果表明，使用5mg/L的药敏纸片，在含4%NaCl的MH琼脂上，经18h孵育，MRSA的检出率为96%，48h的检出率为100%。在不含NaCl的MH琼脂上，18h和48h MRSA 的检出率分别为48%和74%。以上检测结果与采用10mg/L的药敏低片的 检测结果相似。
1.1.4　自动检测系统(Auto-Mesure-System,AMS和Microscan)　Coudron等报告：AMS和Microscan对MRSA的检出率分别为71%和76%。Woods等报告：采用4%NaCl的MH琼脂(含6mg/L甲氧西林)，Microscan法对MRSA的检出率为96.7%，且孵育3.5～15h即可得到可靠结论，绝大多数MRSA能在4.5～7h检出。但专家们认为，用自动系统检测出来的MRSA应该再用第二种方法(如琼脂筛选法或平板扩散法)来确定［2］。
1.1.5　Almar和E试验　Almar试验与肉汤稀释法相似，因此它可作为快速初筛MRSA的方法。它依据指示剂的颜色变化来判定MIC的终点，而E试验的原理则同纸片扩散法类似，只是塑料药敏条上含有上同浓度梯度的同种抗生素。两试验所用的MH培养基均含2%NaCl。Novak 曾收集了127株MRSA，用来检测其可靠性。试验结果表明，Almar和E试验均能准确检测MRSA，其检出率均为100%。当使用不含NaCl MH琼脂时，用E试验检测，有6株MRSA漏检。但E试验操作简单，并且可根据使用者的要求改变药敏条上抗生素的种类以及浓度。
1.6　SSMAC试管法　实验主要是利用试管里的含有clozacillin(6mg/l)的软盐-甘露醇琼脂(Soft salt-mannitol agar-cloxacillin,简称SSMAC)。用拭子在病人感染部位取得标本后，当即把它放进SSMAC试管里，当试管在孵箱中孵育24h后，如果琼脂颜色出现明显改变，则认为原菌株多系MRSA。Mir等人用此方法检测了临床1914个拭子标本，其中有63株(3.3%)被判断为MRSA阳性，1827株(95.4%)被判断为MRBA阴性，另24株(1.2%)为中间型。通过与传统的检测方法比较，认为SSMAC试验有72.7%的敏感性和99.2%的特异性，阳性和阴性预测值分别为76.2%和99.0%。当把中间型的菌株看成MRSA阳性分析时，其相应的以上各项值分别为75.3%、98.2%、63.2%及99%。对于MRSA寄殖的病人，此方法鉴定MRSA的敏感性和特异性分别为89.4%和100%。实验还表明：假阳性主要是由耐甲氧西林的溶血性葡萄球菌引起；而假阴性则主要发生在MRSA菌量很低的气管抽吸物上。总之，SSMAC试管法对于早期诊断MRSA寄殖病人，不失为一种有效、快速且价廉的好方法，从而能尽快采取预防MRSA扩散的措施［3］。
1.1.7　检测hetero-VRSA(heterogeneously vancomycin-resistant Staphylococcusaureus)法　该方法利用万古霉素与β-内酰胺类抗生素对于Mu3菌株(hetero-VRSA)的代表菌株，是从一例术后用万古霉素治疗无效的肺炎病人的痰中分离得到的，其MIC值为3mg/L。)的特殊拮抗性来检测临床MRSA菌株对万古霉素是否具有异质性耐药性。该方法包括以下几步：①把过夜培养的菌液划线于含有4mg/L万古霉素且用心脑浸渍过的琼脂平板上。②把含有任何一种β-内酰胺抗生素的纸片放置于平板上。③在37℃下孵育平板24或48h,然后观察细菌生长情况。由于万古霉素和β-内酰胺抗生素对于Mu3菌株的拮抗性，故Mu3只能生长在β-内酰胺类抗生素纸片的周围。Hanaki等用这种方法对1995-1996年从日本12所医疗机构收集到的321株MRSA进行了检测，结果发现：在24h和48h，分别有12.1%(39株)和20.96%(67株)的MRSA生长于β-内酰胺类抗生素纸片周围。对其中10株菌(分别代表不同的10个医疗机构)进行了耐万古霉素的亚群分析，分现它们与Mu3菌株的异质耐药类型相似。有学者认为此方法因具有简单、快速的特点，故有可能很快代替种群分析法和传统的经典方法［4］。
1.1.8　2小时鉴定法 (two-hour-identification method)　在检测葡萄球菌凝固酶的基础上，利用人凝血酶原和葡萄球菌的一种染色体基因底物(具体资料未公布)来检测MRSA。把葡萄球菌接种于一种特殊的培养基，然后把此培养基与同等量的人凝血酶原和染色体基因底物混合，在37℃下孵育1～2h后，用分光光度计测量波长405nmOD值。Langlet等人用此方法检测了242株葡萄球菌，98.4%的MRSA都在2h后检测出来了。该实验不需要互补实验，其敏感性和特异性分别为99.4%和100%［5］。
　　Perry等人最近发现了一种更为快捷而简便的检测MRSA的固体筛选培养基，即甲氧西林-氨曲南(aztreonam)-甘露醇-盐琼脂。使用这种培养基，只需孵育20h，就可长出可见的MRSA菌落(如没有MRSA菌落，即可排除MRSA)。这种培养基甚至能够检测出低水平耐药的MRSA(MIC在8～16mg/l之间)［6］。
　　以上这些方法中以纸片法最简单易行，琼脂平皿2倍稀释法最为准确。但这些方法都易受培养条件影响，故使MRSA检测的结果不够稳定。
1.2　从蛋白质水平
1.2.1　MRSA筛选实验　即Slide乳胶凝集实验。本实验是通过检测PBP2a抗原来判断MRSA的。实验中，用碱处理法快速抽提PBP2a，以单克隆抗体致敏过的乳胶微粒进行Slide凝集反应。从不含β-内酰胺类抗生素的琼脂平板上挑取一个接种环的菌，在20min以内，PBP2a就能从中检测出来［7］。Van Griethuysen等在PCR法检测出来的267株mecA基因阳性菌株中，用此方法检测出263株(敏感性为98.5%)；所有PCR法判断为mecA基因阴性的菌株都被检出(特异性为100%)。而对照苯唑西林琼脂筛选实验却只筛选出250株mecA基因阳性菌株(敏感性为93.6%)。由于该实验在检测MRSA中，具有高度的敏感性和特异性，并且快速(只需20min)、易操作，故专家们推测MRSA筛选实验在不久就会成为微生物实验室的常规检测方法。但值得注意的是，由于MRSE菌株与MRSA菌株产生同样的PBP2a抗原，所以，MRSA筛选实验应该在排除了凝固酶阴性的MRSE之后才能确定是MRSA［8］。
1.2.2　Slidex Staph-kit方法　本方法是一种与乳胶血凝反应相结合的实验，目的是为检测凝集因子、蛋白A以及金黄色葡萄球菌一种特殊的表面免疫原。凝集因子阳性的菌株引起纤维蛋白原致敏过的红细胞发生血凝反应，进而出现可见的红色团块。而凝集因子阴性的金黄色葡萄球菌与抗金黄色葡萄球菌表面蛋白的一种特殊抗体致敏过的乳胶微粒发生反应后，产生可见的白色团块。Withelhaus等用该方法检测了从病人身上分离得到的150株MSSA和50株MRSA，结果表明，白色团体块对于检测凝集因子阴性的MRSA有99%的特异性和98的阳性预测值。因此认为Slidex Staph kit法能够迅速(甚至在抗生素敏感性实验之前)检测出凝集团子阴性的MRSA流行株［9］。
1.3　从核酸水平
　　最近几年利用分子生物学技术，通过检测meeA基因来鉴定MRSA的方法得到了广泛研究。这些方法不受培养条件的限制，不受细菌耐药表达水平的影响，比传统方法快速、敏感，可直接利用临床标本检测。主要有以下几种方法。
1.3.1　聚合酶链反应(PCR)　根据mecA基因序列设计合成两个寡核甘酸引物，两上引物之间的长度即为要扩增的目的的片段，将处理细菌标本抽提的DNA、设计引物与DNA多聚酶和dNTP混合，然后在PCR热循环仪中按程序扩增约30个循环。取微量反应产物进行凝胶琼脂电泳或杂交鉴定，观察结果。有目的片段的标本中含mecA基因模板，据此可判断原始标本中含MRSA。该方法灵敏度和特异性都高，有快速可自动化的特点，但PCR检测mecA阳性菌株，而并不是所有mecA基因都能表达，它的耐药性还受各种调节基因和辅助基因都能表达，它的耐药性还受各种调节基因和辅助基因的影响，所以美国NCCLS推荐将mecA-PCR法与传统的检测方法结合使用，有利于保证结果的可靠性的准确性［10］。但近来有人用mecA、fmeB复式PCR与免疫分析相结合的方法来检测MRSA，发现其敏感性和特异性都明显比传统方法好，并且整个过程从采集标本开始，仅仅需要24h。因此认为它为MRSA的检测提供了一个更为省时且准确的方法［11，12］。而Kearns等人则发展了一种认为更为快速而可靠的复式PCR法，该方法以同时检测凝固酶基因和mecA基因为基础，全过程只需1.5h［13］。
1.3.2　质粒DNA分析　质粒指纹图谱(plasmid fingerprinting)是用做质粒分析的间接分子生物学技术，具有特异性。包括用琼脂凝胶电泳检测细菌的质粒特征和采用限制性内切酶对质粒DNA进行酶切或做同源性分析质粒图谱的分析表明：引起感染暴发的同源菌株，其质粒电泳图谱基本相同或完全相同，不同来源的菌株则不同。故质粒图谱检查对于MRSA感染的流行病学调查，具有重要作用，可用于追踪传染源。需要注意的是：质粒具有不稳定性，细菌在具有抗生素压力的医院环境中很容易获得转移抗药性的R质粒，但如果环境条件改变时质粒也很容易丢失或重组，从而影响质粒指纹图谱的准确性，解决此问题的关键是尽快地在限定时间内检测质粒。
1.3.3　DNA 杂交技术　诊断MRSA的探针，是用同位素标记的经限制性内切酶酶切或PCR扩增产生的mecA基因制成的，该探针与待测菌株DNA进行杂交，经琼脂糖电泳和转移后，通过放射自显影或其它标记检测方法测定待测菌株的DNA区带。在此基础上，产生了一种列为简便而准确的检测方法，即bDNA(branched-DNA)杂交法［14］。最近，Cloney等人又研究出一种更为快速、简单而且恒热的方法来检测MRSA中的mecA基因，即环状探针技术(Clycling probe Technology,简称为CPT。)。CPT是以比色的酶免疫分析法(Enzyme-immuo-assay,简称EIA)为基础，用荧光素和生物素标记过的5’末端和3’末端制作一个独特的嵌合(chimeric)DNA-RNA-DNA环状序列探针，将此探针用来检测mecA基因内的特殊序列。实验中，用CPT来筛选238株金黄色葡萄球菌菌株，结果与PCR检测mecA基因的结果完全一致。CPT法从培养细菌开始，整个过程只需2h［15，16］。

（待续）

胡杨

2　分型方法

　　主要用于流行病学调查。传统方法有生化、血清学、耐药谱检测、噬菌体分型和质粒分析等方法，前三种表型分析法难以确定待测菌株的遗传变异；而后两种方法又仅能确定某一遗传或生物学标志，故只适于某些特定的MRSA菌株或生物学的分析。但由于这些方法不需特殊设备，易于在基层推广，因此在MRSA流行病学调查中仍有重要作用。近年来随着分子生物学技术的进步，为MRSA的流行病学监测开拓了越来越广泛的前景。其中主要有以下几种新方法。
2.1　质粒和质粒限制性内切酶图谱　此方法具有区分能力强，结果稳定的特点，它可以区分流行株和非流行株，但对于质粒丢失和发生基因重组的菌株以及不含质粒或含质粒很少的菌株，不能够准确分型。
2.2　随机引物PCR扩增产物的多态性(RAPD)　随机引物的根据G?肠杆菌科细菌的重复序列而设计的，这些引物能检测G＋球菌如MRSA的DNA可变区。这种方法不仅可用于细菌分类，也可用于流行病学分析，流行株的PCR产物出现相同的电泳条带。它可区别同一细菌的不同菌种，也可用于不含质粒的细菌的分型，且不需预先知道细菌的基因序列，具有良好的重复性和较高的特异性。Van Belum等报道，RAPD分型能否成功，主要靠随机引物的选择，一条引物难以有效地辨别不同菌株，需多条引物，但随机引物条数愈多，PAPD的操作也愈复杂。
2.3　核酸分子杂交　此方法是采用特异性mecA基因探针和染色体转座子Tn554探针与MRSA染色体进行Southern印迹，根据杂交谱的多态性，不仅可以对这些MRSA进行分型，还可以对其起源进行探讨和判断，从而为控制MRSA的暴发流行提供有力的依据和保证。
2.4　免疫印迹法　该法能区分与临床及流行有关的主要菌群及亚型，结果稳定，与噬菌体分型、耐药谱模式分型的结果相关性良好，但优于这两种方法，噬菌体不能分型的菌株也能用这种方法分型。该方法重复性好，技术难度与噬菌体分型相当。
2.5　染色体DNA限制性内切酶图谱多态性(RFLPs)　因选择的内切酶不同而表现出不同的谱型。RFLPs 的分辨力好，并可用于传染源和传播途径的追踪。Jordens等报道，MRSA流行菌株的染色体DNA限制性内切酶图谱相同，而非流行MRSA菌株的染色体DNA限制性内切酶图谱不同。此方法克服了质粒易丢失等不稳定性缺点，明显优于质粒酶切图谱的方法［17］。
2.6　脉冲场凝胶电泳(PFGE)多态性　染色体DNA用限制性内切酶切割后，用脉冲场凝胶电泳分离各酶切片段，可根据其多态性分型。该方法是目前最为可靠和分辨力最强的分型方法，但操作复杂。Leonard等用PFGE和气相色谱法分析形态学相似的MRSA菌株，发现二者相关性很好，均可用于流行病学调查。故推荐在处理大量标本时，先用气相色谱法筛选，再用PFGE分辨出流行菌株，可省时省力。
2.7　蛋白A基因PCR法　编码蛋白A的基因spa含有几种不同的功能区。而此方法主要针对Fc结合区和X区，前者含有2～5个重复序列，每个序列长为160bp，后者含有最多可达15个长为24bp的重复序列。X区由于重复序列的数目的序列不同而具有高度的多态性。根据spa基因序列，设计三对引物对蛋白A基因内的这两个区域进行选择性扩增，从而对不同的MRSA分型。通过此方法与MRSA其它表型和分子生物学分型方法作对此，得出结论：虽然蛋白A基因PCR分型法费用昂贵，但它对于MRSA仍不失为一种快捷、简便、易标准化且结果易解释的高效的分型方法［18］。
2.8　植物凝集素(Lectin)分型法　这是一种正处于研究中的新方法。它主要是利用32种商品植物凝集素与菌株的凝集反应来分型。在此方法中，每株菌在三种不同的培养基(即Columbia biood agar, Trypticace-soy agar和Chapman)中进行培养，而在不同的培养基中，与每株菌发生凝集反应的凝集素不一样。这种分型法可能会有益于流行病学调查，但它还必须标准化分析的条件(主要是培养基)，从而使得不同实验中心的结果可以作有价值的对比［19］。
2.9　荧光扩增片段长度多态性　(Fluorescent amplified-fragment length polymorphrism, FAFLP)分析法　这是一种新的以PCR为基础的基因分型技术。通过与标准的表型法、凝固酶基因法、RFLP法以及PFGE法比较，认为此方法的区分能力明显比前三种方法强，而重复性明显比PFGE强，并且更易操作［20］［21］。
2.10　凝固酶基因多型性　根据凝固酶基因序列设计引物扩增其可变区，再用AluI内切酶消化PCR产物，最后根据产物电泳的长度多态性分析菌株之间的关系。一般只能将MRSA分成2型。
2.11　mecA基因高变区(HVR)长度多态性　在耐药决定基因mecA和一端类似插入序列因子IS431之间，存在着一段长约204。bp的基因高变区(hypervariable region),它在不同的MRSA菌株中呈现出不同长度的片段。Ryffel等人已经测得其序列，并表明：其长度多态性主要是由一个直接重复单位(direct repeatumit,简称dru)的序列不同引起。最小的dru约40bp,直接重复至少9次。因此在HVR长度多态性的基础上，可以用PCR扩增方法来区分不同的MRSA菌株。它可把MRSA分为5型［22］。至于dru的序列差异和不同重复次数有何具体生物学意义，还有待于进一步探讨。
　　虽然这些方法比传统方法可靠和准确，但由于这些新方法需特殊的操作设备和技术，缺乏标准化，未能推广应用，但如果和传统方法结合，就能更准确地区分MRSA菌株之间的关系，提高MRSA感染流行病学分析结果的准确性。
参考文献：
［1］ RICHARD P,MEYRAN M,CARPENTIER E,et al.Comparison of phenotypic methods and DNA hybridization for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］J.Clin Microbiol,1994,32(3):613-617.
［2］ ROKOSZ A,SAWICKA-GRZELAK A,MENSEL-MIKOLAJCZYK F.Comparison of several methods for detection of methicillin resistance in clinical strains of Staphylococcussp［J］.Med Dosw Mikrobiol,1997,49(1-2):19-25.
［3］ MIR N,SCANCHEI M,BAQUERO F,et al.Soft salt-mannitol agar-cloxacillin test:a highly specific bedside sereening test for detection of clolnization with methicillin resistant Staphylococcus arueus［J］.J Clin Mecrobiol,1998,36(4):986-989.
［4］ HANAKI H,INABA Y,SASAKI K,et al.A novel method of dectecting Staphylococcus aureus heterogeneously resistant to vancomycin(hetero-VRSA)［J］.Jpn J Antibiot,1998,51(8):521-530.
［5］ LANGLET S，QUENTIN G，CONTANT G，et al.A Chromogenic method for rapid identification of Staphylococcus aureus［J］.Ann Biol Clin(Pris),1999,57(2):191-196.
［6］ PERRY PL,COOMBS GW,BOEHM JD,et al.A rapid(20h) solid screening medium for detecting methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Hosp Infect,1998,40(1):67-72.
［7］ NAKATOMI Y,SUGIYAMA J.A rapid latex agglutination assay for the dection of penicillin-binding protein2'［J］.Microbiol Immunol,1998,42(11):739-743.
［8］ VAN LEEUWEN WB,VAN DECT C,LUIJENDIJK A,et al.Rapid detection of methicillin resistance in Staphyloccus aureus isolates by the MRSA-Screen latex agglutination test［J］.J Clin Microbiol,1999,37(9):3029-3030
［9］ WITHELHAUS TA,KERN S,SCHAFER V,et al.Rapid detection of epidemic strains of methicllin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Clin Microbiol,1999,37(3):690-693.
［10］ ARAJ GF,TALHOUK RS,SIMAAN CJ,et al.Discrepancies between mec A PCR and conventional tests used for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus［J］.Int J Antimicrob Agents,1999,11(1):47-52.
［11］ JONAS D,GRUNDMANN H,HARTUNG D,et al.Evaluation of the mecA femB duplex polymerase chain reaction for dection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis,1999,18(9):643-647.
［12］ TOWNER KJ,TALBOT DC,CURRAN R,et al.Development and evaluation of PCR-based immunoassay for the rapid detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Med Microbiol,1998,47(7):607-613.
［13］ KEARNS AM,SEIDERS PR ,WHEELER J,et al.Rapid detection of methicllin-resistant Staphylococcus by multiplex PCR［J］.J Hosp Infect,1999,43(1):33-37.
［14］ KOLBERT CP,ARRUDA J,VORYA-DELMORE P.Branched-DNA assay for detection of the mecA gene in oxacillin-resistant and oxacillin-sensitive Staphylococci［J］.J Clin Microbiol,1998,36(9):2640-2644.
［15］ CLONEY L,MARLOWE C,WONG A,et al.Rapid detection of mecA in methicillin-resistant Staphyloccus aureus using cycling probe technology［J］.Mol Cell Probes 1999,13(3):191-197.
［16］ BEKKAOUI F,MCNEVIN JP,LEUNG CH,et al.Rapid detection of the mecA gene in methicillin resictant Staphylococci using a colorimetric cycling Probe technology［J］.Diagn Microbiol Infect Dis,1999,34(2):83-90.
［17］ TELECLO S,BARBARINI D,CARRETTO E,et al.Typing of methicillin-resistant Staphylococcus auseus(MRSA)strains from an intensive care unit by random amplified polymorphic DNA［J］.New Microbiol,1999,22(4):323-329.
［18］ SHOPSIN B,GOMEZ M,MONTGOMERY SO,et al,Evaluation of protein A gene polymorphic region a DNA sequencing for typing of Staphylococcus aureus strains［J］.J Clin Microbiol,1999,37(11):3556-3563.
［19］ MUNOZ A,ALVAREZ O,ALONSO B,et al,Lectin typing of methicillin-resistant Staphyloccus aureus［J］.J Med Microbiol,1999,48(5):495-499.
［20］ GRADY R,DESAI M,O'NEILL G,et al.Genotyping of epidemic methicillin-resistant Staphylococcus aureus phage type 15 isolates by fluorescent amplified-fragment length polymorphrism analysis［J］J Clin Microbiol,1999,37(10):3198-3203.
［21］ HOODEY JV,EDWARDS V,RATED S.Use of fluoreseent amplified fragment length polymorphism (FAELP)to characterise methicillin-resistant Staphylococcus aureus［J］.J Methods,1999,37(1);7-15.
［22］ SCHMITZ F J M,STEIERT.H-V,TICHY B,et al.Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates from Dusseldorf by six genotypic methods［J］,J Med Microbiol,1998,47:341-351.

樵夫

一种快速、准确地检测方法对临床的帮助是很大的。

绿茵场

够专业，一时难于理解。:P

梁梁的鱼

很不错的帖子，总结的很全面！可不可以把各种方法的优缺点总结成一张图呢，更直观！学习了！