.9 铜绿假单胞菌检查(参照GB7918.4)
6.9.1增菌、分离:取样液1mL,加入到5mL SCDLP培养液中,充分混匀,置35℃±2℃培养18h~24h。如有铜绿假单胞菌生长,培养液表面呈现一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。从培养液的薄菌膜处挑取培养物,划线接种十六烷三甲基溴化铵琼脂平板,置35℃±2℃培养18h~24h,观察菌落特征。铜绿假单胞菌在此培养基上生长良好,菌落扁平,边缘不整,菌落周围培养基略带粉红色,其他菌不长。
6.9.2生化反应:取可疑菌落涂片作革兰染色,镜检为革兰阴性菌者应进行下列试验:
6.9.2.1氧化酶试验:取一小块洁净的白色滤纸片放在灭菌平皿内,用无菌玻棒挑取可疑菌落涂在滤纸片上,然后在其上滴加一滴新配制的1%二甲基对苯二胺试液,30s内出现粉红色或紫红色,为氧化酶试验阳性,不变色者为阴性。
6.9.2.2绿脓菌素试验:取2个~3个可疑菌落,分别接种在绿脓菌素测定用培养基斜面,35℃±2℃培养24 h,加入三氯甲烷3mL~5mL,充分振荡使培养物中可能存在的绿脓菌素溶解,待三氯甲烷呈蓝色时,用吸管移到另一试管中并加入1mol/L的盐酸1mL,振荡后静置片刻。如上层出现粉红色或紫红色即为阳性,表示有绿脓菌素存在。
6.9.2.3硝酸盐还原产气试验:挑取被检菌纯培养物接种在硝酸盐胨水培养基中,置35℃±2℃培养24 h,培养基小倒管中有气者即为阳性。
6.9.2.4明胶液化试验:取可疑菌落纯培养物,穿刺接种在明胶培养基内,置35℃±2℃培养24h,取出放于4℃~10℃,如仍呈液态为阳性,凝固者为阴性。
6.9.2.5 42℃生长试验:取可疑培养物,接种在普通琼脂斜面培养基上,置42℃培养24h~48h,有铜绿假单胞菌生长为阳性。
6.9.3 结果报告 被检样品经增菌分离培养后,证实为革兰阴性杆菌,氧化酶及绿脓菌素试验均为阳性者,即可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。如绿脓菌素试验阴性而液化明胶、硝酸盐还原产气和42℃生长试验三者皆为阳性时,仍可报告被检样品中检出铜绿假单胞菌。
6.10 金黄色葡萄球菌检查(参照GB7918.5)
6.10.1增菌、分离:取采样液1mL,接种于 5mL SCDLP 液体培养基中,于36℃±1℃增菌24h。取1白金耳上述增菌液,在血平板上作划线分离,36℃±1℃培养24h。
6.10.2观察菌落特征:在血琼脂平板上菌落形态为金黄色、圆形凸起、 表面光滑、周围有溶血圈。
6.10.3镜检:挑取典型菌落作涂片染色镜检,镜下为革兰阳性、成葡萄状排列的球菌。
6.10.4生化反应:取可疑菌落作触酶、葡萄糖发酵、血浆凝固酶、甘露醇发酵、新生霉素敏感试验,均为阳性者即为金黄色葡萄球菌。
6.10.4.1甘露醇发酵试验:取上述可疑菌落接种于甘露醇培养基,于36℃±1℃培养24h,发酵甘露醇产酸者为阳性。
6.10.4.2血浆凝固试验:①玻片法:洁净玻片一端滴一滴灭菌生理盐水,另一端滴一滴血浆,用白金耳挑取菌落分别与生理盐水和血浆混匀,5min内观察有无固体颗粒状物,若血浆出现凝块,生理盐水均匀混浊为阳性,两者均混浊为阴性。②试管法:吸取 1:4新鲜血 0.5mL,放在灭菌小试管中,再加入等量待检菌24h肉汤培养物,混匀后放入36℃±1℃孵箱中,同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌肉汤培养物作对照,每30s.观察一次,6h内出现凝块者为阳性。
6.11 大肠菌群检查(参照GB4789.3)
6.12 乙型溶血性链球菌检测(参照GB4789.11)
6.12.1增菌、分离:取样品1mL,接种于1%葡萄糖肉汤,37℃增菌24h。取1白金耳增菌液在血平板上作划线分离,36℃±1℃培养24h。
6.12.2观察菌落特征:菌落形态为灰白色、半透明或不透明、针尖状突起、表面光滑、 边缘整齐、周围有β溶血圈。
6.12.3镜检:挑取典型菌落作涂片染色镜检,镜下为革兰阳性、呈链状排列的球菌。
6.12.4生化反应:取可疑菌落作如下生化试验,如触酶阴性、链激酶试验阳性、对杆菌肽敏感者,即为乙型溶血性链球菌。
6.12.4.1链激酶试验:吸取草酸钾血浆0.2mL(0.02g草酸钾加5mL人血浆混匀,经离心沉淀,吸取上清),加入0.8mL灭菌生理盐水混匀后再加入待检菌24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL,混匀,放入36℃±1℃水浴中,每2min观察一次(一般10min内可凝固),待血浆凝固后继续观察并记录溶化的时间,如2h内不溶化,移入孵箱观察24h的结果,如全部溶化为阳性;24h仍不溶解者为阴性。
6.12.4.2杆菌肽敏感试验:将被检菌浓菌液涂于血平板上,用灭菌镊子取含菌 0.04 单位杆菌肽纸片放在平板表面上。同时以已知阳性菌株作对照,于36℃±1℃ 18h~24h,有抑菌带者为阳性。
6.13 沙门氏菌检查(参照GB4789.4)
6.14 污水、污泥采样及检查方法
按GB18466《医疗机构水污染物排放标准》执行。
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