脓毒症新进展－检测技术和诊断策略

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讲者丨吴文娟（同济大学附属东方医院）
整理丨刘水桂（南昌三三四医院）审核丨蓝雪0816来源丨SIFIC 2024“全国感控与耐药感染”联合大会
脓毒症是一种源于感染的全身性炎症反应综合征，在其发展过程中，患者会出现器官功能障碍、休克或多器官功能衰竭导致死亡。当前，脓毒症是重症监护室患者的主要死亡原因。20多年以来，全球研究人员针对脓毒症的定义和诊断标准进行了三次重大修订，但脓毒症的死亡率仍然较高。同济大学附属东方医院吴文娟教授在《脓毒症新进展－检测技术和诊断策略》中结合国内外最新的相关文献，总结脓毒症检测技术和诊断策略的最新进展。这对帮助临床医务人员合理使用相关的检测技术，及时诊断脓毒症，提高病人的治愈率有很重要的意义。

                               
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PART一
脓毒症的相关知识
2016年美国重症医学会（SCCM）和欧洲重症医学会（ESICM）联合发布脓毒症的最新诊断标准，可概括为感染和脏器功能衰竭会导致脓毒症。病人在感染性疾病高发环境中，大量、长期、联合和不恰当使用抗菌药物，经常给予体外生命支持，从而造成宿主免疫功能下降及器官功能障碍，发生脓毒症。
脓毒症时血液中存在病原体，一种情况是由病毒引起血源性感染，另一种情况是由细菌、真菌引起血流感染。血流感染是患者血液里存在病原微生物，同时伴有或不伴有感染的症状和体征。血流感染分为社区获得性血流感染、医院获得性血流感染及社区保健相关血流感染等类型。
2022年发表《血流感染临床检验路径专家共识》是由上海市微生物学会临床微生物学专委会、上海市医学会检验医学专科分会及上海市医学会危重病医学专科分会共同撰写。《血流感染临床检验路径专家共识》主要针对危重症患者制定，从基于患者风险分级的诊断流程、血流感染临床检验技术评价和应用、结果报告和临床应用等方面进行临床问题构建，文献检索及综合分析。应用评价分级（GRADE）方法分析文献，确定推荐等级，形成了19条推荐条目。为了加快诊断并最终改善血流感染患者临床预后，本共识提出以下临床诊断路径。

                               
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注：qSOFA为快速序贯器官衰竭评分；SOFA为序贯器官衰竭评分；APACHE Ⅱ为急性生理学和慢性健康状况评价Ⅱ。
PART二
脓毒症的检测技术
（一）结合患者流行病学和临床表现，临床医师可基于可疑的病原体种类选择适宜的病原学检测方法并采集相应的临床标本送检，2024年进行更新后的不同病原体的检查方法和样本要求见表1。

                               
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注：a核酸检测包括荧光定量聚合酶链反应，微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR），宏基因组学第二代测序（mNGS）和即时检测核酸检测方法，b血培养标本采集时，除特殊情况外，标本一般指静脉血。c报告时间为单一样本单次检测所需时间。
（二）直接核酸检测技术的分类直接核酸检测包括聚合酶链反应（PCR）、ddPCR、mNGS和荧光原位杂交（FISH），实验室应结合不同检测方法的性能特征、检测周转时间、影响因素等进行方法学评价，并在临床沟通中向临床医师推荐检验项目优化选择。各种检测方法的特点见表2。

                               
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（三）病原体分子诊断技术目前的分子诊断技术有聚合酶链式反应（PCR）、脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）、基质辅助激光解析电离质谱（MALDI-TOF）、双脱氧测序法（Sanger）、多重定量PCR分型技术（MLVA）、全基因组测序（WGS）、宏基因组第二代测序技术、微滴式数字聚合酶链反应（ddPCR）、分子即时检测（MPOCT）等方法。每种技术都不是完美的，如何使用好这些检测技术，临床的解读比技术更重要。现阶段检测技术更新非常快，但每种技术如何使用，这是临床面临的最大的挑战。
《成人呼吸道感染病原诊断核酸检测技术临床应用专家共识（2023）》《病原宏基因组高通量测序临床本地化检测规范专家共识》《侵袭性真菌病真菌学检测指南》和《重症监护室成年患者的侵袭性真菌疾病：2024年ESGCIP、ESICM、MSGERC和ISHAM的定义共识》等专家共识，这些都是分子诊断技术在临床应用的体现。
PART三
脓毒症案例分享
（一）病人的基本信息病人，男性，2023年6月17日19:10-21:50进行腹腔镜下粘连松解＋冲洗引流术，腹腔见大量白色脓性浑浊液，约3000ml，全小肠表面附着脓苔，粘连呈团块，结肠扩张，胃、大网膜包裹成饼状。分解粘连后探查胃、十二指肠及后壁、小肠、结肠未见明显穿孔等异常。患者麻醉过程顺利，血压心率稳定，生命体征平稳。术后从胃肠病（外）科转入A4重症监护室，亚胺培南西司他丁1g，q8h静滴治疗。
（二）检查结果1.术前实验室检查结果2023年6月17日急诊检验白细胞7.74×109/L，N91.4%↑,C反应蛋白检查（CRP）140.79mg/L↑。
2.术后实验室检查结果2023年6月18日乙肝表面抗原阳性，丙肝抗体阴性，梅毒螺旋体特异性抗体阴性，梅毒螺旋体非特异性抗体阴性，人免疫缺陷病毒阴性。抗凝血酶50.3%↓，血栓调节蛋白29.73TU/mL↑，活化部分凝血活酶时间47.4秒↑，D-二聚体580mg/L，FEU↑，降钙素原17.90ng/ml↑，快速C反应蛋白141.65mg/L↑，中性粒细胞百分比94.2%↑，肌酐250umol/L↑。
2023年6月23日术后首次血培养报告阴性（6月18日送检），白介素6293.0pg/ml↑，降钙素原14.300ng/ml↑。白细胞13.29×109/L↑，快速C反应蛋白107.04mg/L↑，血清淀粉样蛋白>288.00mg/L↑．中性粒细胞百分比93.0%↑。
（三）病情进展情况1.2023年6月24日患者药物镇静中呼之不应。全身水肿，全身散在破损，背部散在出血点，右下肢5×5cm的破渍，左腹股沟大片瘀青。尾骶部8×8cm I期压疮，左小腿外侧3×8cm I期压疮。静脉滴注人血清白蛋白。患者全身水肿，予口服利尿剂脱水。继续抗感染，给予泰能＋替加环素治疗。
2.再次送检血培养，2023年6月24日检查结果报告右侧厌氧：找到革兰阳性球菌，质谱快速鉴定为屎肠球菌（微生物一级报告）。2023年6月25日检查结果报告右侧需氧：找到革兰阳性球菌，质谱快速鉴定为屎肠球菌（微生物一级报告）。
3.危重病例经讨论后，目前诊断：（1）原发性腹膜炎；（2）脓毒血症脓毒性休克；（3）肺部感染呼吸衰竭；（4）中度贫血血小板减少；（5）慢性肾衰竭G4期紫癜性肾炎；（6）过敏性紫癜；（7）低蛋白血症；（8）单克隆免疫球蛋白血症；（9）胆囊结石；（10）高血压3级（极高危）。抗感染治疗用泰能＋替加环素，后来调整为泰能＋万古霉素，抗炎用甲强龙。经注射用亚胺培南西司他丁1g静滴q8h＋注射用盐酸万古霉素500mg静滴q12h，治疗3天效果不明显。
4.2023年6月28日WBC7.97*109/L，N95.0%↑，IL-691.1pg/ml↑，PCT4.230ng/ml↑，血清G试验阴性，GM试验3.786强阳性；考虑真菌血流感染可能，加上卡泊芬净50mg静滴qd，邀请特殊类抗菌药会诊专家组成员会诊。
同时实施操作：纤维支气管镜检查及肺泡灌洗术。肾功能不全，有连续肾脏替代治疗（CRRT）指征，行CRRT。
（四）再次实验室检查与临床处理

• 2023年6月29日真菌培养及鉴定（痰）：培养5天无真菌生长。
• 2023年6月29日mNGS血浆：屎肠球菌、马尔尼菲篮状菌；支气管肺泡灌洗液（BALF）检出嗜麦芽窄食单胞菌。
• 2023年6月30日肺泡灌洗液培养：嗜麦芽窄食单胞菌≥105cfu/ml;
• 2023年6月30日痰液培养：嗜麦芽窄食单跑菌+++；血培养左侧需氧报阳，左侧厌氧培养五天无细菌生长。根据培养细菌（马尔尼菲篮状菌）使用针对该细菌的药物进行治疗。
• 马尔尼菲蓝状菌使用酵母相和菌丝相分别进行药敏试验，两种方法的结果一致。（MIC值分布与本实验室此前做过的99株马尔尼菲蓝状菌药敏结果相符）。给予伏立康唑+两性霉素B脂质体爬坡治疗。
• 马尔尼菲蓝状菌抗原、抗体检测均为阴性，可能是病人免疫受损、自身免疫性疾病或抗原靶位差异，尚不能确定。
• 2023年7月13日实验室检查结果综述：血液检测屎肠球菌和马尔尼菲篮状菌，疑似病原未检出；检测发现十二项细胞因子中的IL6、IL8和IL10的值升高；尿蛋白、γ-谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、肌酐、白细胞、淋巴细胞、C反应蛋白都升高。
  

7月中旬病人放弃治疗。该病人经历多次会诊讨论，他的治疗给我们带来一些经验，医务人员需要整合微生物检测技术改善临床诊断，从而提高病人的治愈率。
PART四
脓毒症的诊断策略
（一）2023年美国微生物学（ASM）年会，几个板块内容提出整合微生物检测技术改善临床诊断，人类对感染性疾病的认知一定不是单一的。
（二）脓毒症疾病进展机制的主要生物标志物，分析参考2017年至2022年发表的研究。很多文章探讨宿主基因如何表达联合应用。
（三）脓毒症快速发现的流程

                               
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（四）SepSMART是基于宿主基因表达的检测SepSMART检测（约1小时）帮助医生区分脓毒症与非感染性全身炎症反应综合征（SIRS）。SepSMART可在1小时左右评估病人进展为脓毒症的风险，协助医生提高诊断准确率，预计SepSMART产品可应用的场景包括急诊、重症监护室、检验科等科室。
（五）基于病原核酸和宿主生物标志物的整合诊断主题研究基于病原核酸和宿主生物标志物的整合诊断主题研究较多，2022年发表的文章显示，真实世界的研究发现检出最多的病原体不等于致病，病原体核酸检测通常无法区分病原体有活力和无活力、定植或活动性感染等特性，因此阳性结果也仅表明在当前标本中某种病原体DNA或RNA检测阳性，不代表一定由该病原体引起感染。
（六）基于血浆游离DNA定量的机器学习模型1.机器学习模型研究方法2021年8月至2023年8月对疑似脓毒症患者（年龄中位数69岁）进行前瞻性观察研究，收集病人人口统计学特征，生命体征及实验室结果。实验采用mNGS检测方法，以每毫升血浆中微生物特异性游离DNA的拷贝数（CPM）作为检测信号来评估微生物含量。随机森林分类器的准确率、曲线下面积（AUC）和F1分数分别为0.830、0.918和0.856，优于训练集中的其他机器学习模型。该模型展示了临床可解释性，并在区分细菌性放毒症和非脓毒症方面取得了良好的预测性能，测试集中的AUC值为0.85，平均精度为0.91。
2.shapley加性解释—随机森林chassifier模型九个特征的总结，SHAP通过计算每个特征对模型输出的边际贡献，来解释模型预测结果。这种方法可以提供全局和局部的解释，帮助理解复杂模型的决策过程。
小结目前，脓毒症检测技术有微生物检测技术、组学检测技术、感染状态评估、多场景分层交互及病原核酸与宿主反应机器学习模型。未来是整合宿主反应和微生物检测的全局模式，进行5R诊断策略（正确病人、正确标本、正确方法、正确诊断报告及正确解读），构建人工智能（AI）智慧模型，从而构建脓毒症新的诊断工具与治疗策略，是未来脓毒症新的诊疗方向。
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