【感染科普笔记2024-9-10】倪语星｜侵袭性真菌病的实验室诊断方法

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讲者丨倪语星（上海交通大学医学院附属瑞金医院）
整理丨邹林（佛山市第二人民医院）
审核丨蓝雪0816
来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会

侵袭性真菌病的患病率及病死率呈持续上升趋势，严重威胁患者健康。早期确切诊断是改善侵袭性真菌病患者预后的关键。实验室诊断方法主要包括微生物学检查（真菌直接镜检、真菌培养和鉴定、真菌血清学检查、分子生物学检测）和组织病理学检查。在SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会上，上海交通大学医学院附属瑞金医院倪语星教授在《侵袭性真菌病的实验室诊断方法》中重点对真菌诊断的微生物学检查进行了详细的讲解，促进临床医师及临床微生物工作人员深入了解并合理应用这些方法，提高侵袭性真菌病诊断水平。



侵袭性真菌病（IFD）

• 定义：是指真菌进入血液并随血液播散至其他部位甚至全身，引起的侵袭性真菌病。
• 危险因素：长期大量使用抗生素或长期中心静脉插管并使用静脉营养液，体内菌群失去平衡，真菌进入血液并经血行途径播散至局部或全身。
• 临床表现：患者主要表现为持续高热、呼吸困难、腹泻等多器官受累症状。
• 侵袭性真菌病感染病原菌：临床上引起播散性真菌病的真菌主要有三种。（1）念珠菌：在我国，念珠菌是IFD最主要的病原菌，报道占比高达 91%。（2）曲霉：总体感染率在0.29%～14%之间，死亡率高达40%～90%。（3）隐球菌：HIV合并隐球菌病病死率在发达地区达10%～30%，在发展中国家高达13%～70%。
  

侵袭性真菌病（IFD）实验室诊断方法

（一）真菌直接镜检1.送检要求（1）临床样本在做真菌培养同时应做真菌直接镜检。（2）直接镜检操作简便、适用多种临床样本（支气管肺泡灌洗液、痰液、尿、便、分泌物、脑脊液、引流液等）、可快速报告结果，有重要临床价值。（3）免疫抑制人群的支气管肺泡灌洗液（BALF）及无菌体液（除血液外）标本，应做真菌直接镜检，同时做真菌培养及血清学检查；培养+直接镜检+血清学 。（4）非无菌部位标本（痰、尿、便等），如果做真菌培养，需要：培养+直接镜检  标本镜检时建议进行荧光染色。
2.直接镜检方法（1）不染色法-KOH法：取病发、皮屑、甲屑等置于载玻片上，加1滴10%～20% KOH液，盖上盖玻片并微加热透化，镜下可见孢子、菌丝形态。（2）染色法－常用革兰染色：乳酸酚棉兰染色、墨汁染色、荧光染色等。
3.真菌直接镜检观察形态特征举例（1）革兰染色：白念珠菌常单个为芽，有假菌丝者末端缩窄仍附于菌上，似香肠样连接，菌丝多有分隔 。（见图1）



图1 白念珠菌革兰染色
（2）10%KOH直接压片 ：黄曲霉有隔菌丝存在呈双义型的45°分枝，菌丝较大。（见图2）



图2 黄曲霉KOH法
（3）直接涂片法：黑曲霉分生孢子梗长，小分生孢子表面粗糙。（见图3）



图3 黑曲霉直接涂片
（4）墨汁染色：新生隐球菌，大小变异甚大，球形或橄榄球形，在墨汁黑背景下呈现清楚的晕圈，且在晕圈内可见菌体细胞。（见图4）



图4 隐球菌墨汁染色
4.真菌直接镜检优缺点

• 优点：直接镜检是IFD实验诊断最经典的方法，推荐培养+镜检 。其优势在于快速，能为鉴定真菌类型提供最初线索， 有时对一些形态特别的致病真菌可以直接判定（如隐球菌）。
• 缺点：真菌直接镜检敏感性不高，需要多次送检来提高检出率。真菌直接镜检需要经验。镜检阴性结果不能排除真菌感染，必须结合培养结果。
  

（二）真菌培养及鉴定1.送检要求：①在送检真菌培养检查同时，应尽可能同时送检真菌直接镜检。推荐：培养+镜检 。②组织标本进行组织病理检查时，同时应进行真菌培养检查。③真菌培养时间长于细菌培养，一般需要7d，特殊情况需要2～4周以上，如果怀疑双相真菌感染（马尔尼菲蓝状菌、组织胞浆菌等），应同时在28 ℃和37 ℃两个温度下培养。④非无菌部位真菌培养阳性，存在污染菌或定植菌可能，需要对培养所获真菌进行判断，是否有临床意义（即致病真菌），需要结合其他检查如：真菌直接镜检、组织病理检查 、临床表现以及真菌致病性等进行综合判断。⑤真菌鉴定一般需要鉴定到种或复合群（complex）水平。根据菌种类型，参考相应真菌感染诊疗指南选择抗真菌药物治疗。少见真菌或从疑难重症患者分离到的致病真菌应做体外药敏试验，作为临床用药参考。
2.真菌培养培养基选择（1）念珠菌：选择CHROMagar Candida，37℃孵育48h。（2）曲霉、青霉、镰刀霉等：初分离培养基选择SDA，鉴定选择Czapek或PDA培养基，26℃-37℃孵育3～7d。（3）皮肤癣菌：选择SDA，26℃～28℃孵育2～3w。
3.真菌培养菌落形态应与镜检形态相结合（1）曲霉的菌落形态与显微镜下形态观察。


（2）双相真菌培养：同时在28℃和37℃两个温度下培养。例如马尔尼菲蓝状菌 SDA培养基。28℃时生长快速，菌落呈多细胞菌丝相（传播相）生长，具有帚状枝及分生孢子（conidium）链，2～3天即产生特征性的水溶性葡萄酒红色素；37℃时培养呈酵母相（致病相），生长较缓慢，菌落无色素产生，卵圆形、椭圆形酵母样孢子，孢子中间可见分隔为腊肠形。



4.真菌培养及鉴定临床意义真菌培养及鉴定临床意义包括：①发现明确的致病菌（如新生隐球菌），诊断即可确立。②分离出条件致病菌（如白念、曲霉等）应结合临床情况进行判断。③无菌部位（如血液或脑脊液中）分离出条件致病菌常提示明确的感染。④确定菌种对选择抗真菌药物有重要意义！（如克柔念珠菌对氟康唑天然耐药；土曲霉、尖端赛多孢霉、足分枝霉对两性霉素B耐药 ）。
5.真菌培养鉴定的优缺点

• 优点：培养法可以提高病原体检出的阳性率 ，验证直接镜检的结果 ，确定病原菌的种类，预测药物敏感性，或进一步做药敏试验 。
• 缺点：培养法耗时较长，需要一定的条件 。
  

（三）真菌药敏试验1.真菌药敏试验要求包括：①某些真菌存在天然耐药，一般可根据菌种鉴定结果，参考各种真菌感染诊治指南或共识，选择恰当的抗真菌药物治疗。②念珠菌获得性耐药有增多趋势，推荐对确认致病的念珠菌进行体外抗真菌药敏试验，定植念珠菌可不做体外药敏试验。③曲霉等丝状真菌一般不需要体外药敏试验。若患者有唑类药物暴露史，可对分离到的曲霉进行体外药敏试验。
2.真菌药敏：CLSI推荐的方法


3.不同真菌药敏方法的评价

• 肉汤常量稀释法：需要各种原料药，对操作的要求很高，结果用肉眼判断，无法常规开展。
• 微量稀释法：预制好含药的微量稀释板，可实现商品化并与自动仪器配套，自动读取结果 。目前国内批准使用的仅有酵母菌药敏系统。
• 纸片扩散法：操作简便，快速，便于临床实验室常规开展，目前仅适用酵母菌（氟康唑、伏立康唑）。
  

（四）真菌血清学检测方法1.真菌血清学检测方法主要包括三中抗原检测与两种抗体检测


2.真菌（1-3）－β-D葡聚糖检测（G试验）（1）检测原理：1,3-b-D-葡聚糖（1,3-β-D-glucan, BDG）是真菌细胞壁特有成分，占真菌细胞壁成分>50%，广泛存在于各种真菌，对BDG的检测也可称为G试验。作为侵袭性真菌的早期检测的重要指标
（2）临床意义

• 阳性意义 泛真菌筛查：可检测多种致病真菌感染，如念珠菌、曲霉菌、肺孢子菌、镰刀菌、地霉、组织胞浆菌、毛孢子菌等，不能检测隐球菌和接合菌 。区分定植和感染 。指导临床科学合理使用抗菌药物 。对于念珠菌血症，G试验检测是首选检查。
• 阴性意义 ：G试验对侵袭性真菌感染的阴性预测值为90%～95%，建议作为IFD筛查的有效手段，快速排除IFD的可能。
  

（3）判断标准

• 诊断侵袭性念珠菌病：国内外指南推荐G试验在诊断侵袭性念珠菌病时采用单一阈值，且推荐连续做 2次检测：＞ 80 pg/mL。
• 诊断耶氏肺孢子菌（PJP）：G试验对于检测耶氏肺孢子菌（PJP）也有很大价值，在排除其他侵袭性真菌病的情况下，2次或以上的血清 ≥ 80 pg/mL，可以考虑 PJP，但阴性排除 PJP 的价值高于阳性诊断 PJP 的价值 。
  

（4）G试验的影响因素

• 假阳性：抗肿瘤制剂：蘑菇多糖、裂褶菌多糖。免疫制剂：白蛋白、球蛋白。血透使用纤维素膜。手术中使用棉纱垫、棉拭子等 。
• 假阴性：棘白菌素类：抵制BDG合成。
  

（5）G试验评价

• 优点：广谱：可检测念珠菌、曲霉菌和肺孢子菌等多种真菌；快速：可在1.5～2h得出检测结果。早期检测，一般早于临床症状呈阳性。可定量检测；动态观察，评估病情严重程度和治疗效果；标本采集方便 。
• 缺点：不能检测隐球菌和接合菌（如毛霉）感染；不能区分真菌菌种；影响因素较多。
  

3.曲霉半乳甘露聚糖检测（GM试验）（1）检测原理曲霉菌细胞壁上的半乳甘露聚糖（Galactomannan, GM）是曲霉菌菌丝在组织中生长时由菌丝顶端释放入血、肺泡灌洗液或者脑脊液中，当这些体液中检测到GM的存在时，可以作为曲霉感染临床诊断的微生物学证据。
（2）送检建议GM试验是国内外指南推荐的侵袭性曲霉病诊断的检测项目。对高危患者建议每周检测2次。预防性抗真菌治疗会显著影响GM检测敏感性。肺泡灌洗液GM检测效果优于血清GM，但是要注意标准化操作。G与GM试验联合检测显著提高对侵袭性曲霉菌病的检出率。
（3）GM试验的临床意义和判断阈值GM试验阈值尚存争论。2019 年 EORTC/MSG 第三版侵袭性真菌病（IFD）指南推荐检测血清、支气管肺泡灌洗液（BALF）、血浆和脑脊液中GM诊断IA：单份＞1.0为阳性：血清或血浆；BALF；CSF。同时检测血清和BALF时：血清＞0.7，BALF＞ 0.8。
（4）GM 试验的影响因素

• 假阳性：抗菌药物使用：阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、碳青霉烯类、亚胺培南/西司他汀。其他侵袭性真菌病（青霉、镰孢霉、组织胞浆菌、皮炎芽生菌等）。新生儿双歧杆菌定植。多发性骨髓瘤。
• 假阴性：非粒缺患者与慢性肉芽肿患者。
  

（5）GM试验评价

• 优点：GM试验阳性提示患者侵袭性曲霉菌病。辅助早期诊断，GM试验阳性早于临床症状呈阳性。可定量检测，动态观察，评估病情严重程度和治疗效果。标本采集方便 。
• 缺点：对非粒细胞缺乏患者敏感性差 。对慢性肺曲霉菌病患者敏感性差。影响因素较多。
  

4.隐球菌荚膜多糖抗原检测（GXM）2019年EORTC/MSG侵袭性真菌病指南：脑脊液或血液中的CrAg阳性已作为隐球菌感染的确诊依据。隐球菌感染者，早期无任何临床症状和影像学改变，仅表现为血液隐球菌荚膜多糖抗原检测阳性。研究显示，血清中的隐球菌荚膜多糖抗原可以早于临床症状3周检测到。胶体金法灵敏度优于其他隐球菌抗原检测方法。

• GXM抗原检测优点：隐球菌感染的确诊依据，实现早期诊断。方法简单，敏感度和特异性高（90%以上）。滴度提示疾病的严重程度。取材方便，可用于检测血液、脑脊液和BALF。
• GXM抗原检测缺点：抗真菌治疗成功后仍呈阳性，不能作为治疗有效的指标。试剂价格相对较高。
  

5.真菌联合检测推荐方案真菌联合检测有以下几种方案供选择：（1）非严重免疫抑制/缺陷且致病真菌种类较为复杂的患者推荐真菌全项目联合检测：G+GM+GXM+曲霉IgG+念珠IgG。（2）存在免疫缺陷/严重免疫抑制患者推荐真菌抗原联合检测：G+GM+GXM。（3）非严重免疫抑制/缺陷，存在肺部影像学并怀疑曲霉感染患者推荐曲霉菌抗原抗体联合检测：G+GM+曲霉IgG。（4）怀疑感染性脑膜炎或存在肺部不明结节影考虑隐球菌感染的患者推荐隐球菌联合检测：G+GXM。（5）以念珠菌感染常见的患者群体推荐念珠菌抗原抗体联合检测：G+念珠IgG。
（五）真菌的分子学诊断1.分子学诊断现状商品化真菌分子检测方法有限，国外有念珠菌T2 magnetic resonance（T2 MR）结合PCR技术检测念珠菌血症。荧光定量PCR方法在多种深部感染真菌（曲霉、肺孢子菌、念珠菌）检测中有应用前景。二代测序对真菌的检测应用需要技术提升并积累更多的临床证据。质谱鉴定推荐：形态学+质谱，可获得快速、准确的鉴定结果。
2.T2 Biosystems磁共振技术，美国医疗诊断平台T2 Biosystems成立于2006年，利用纳米技术和小型化磁共振技术，实现脓毒症和念珠菌病等疾病的快速诊断。只需3～5小时鉴定到种。念珠菌T2 magnetic resonance（T2 MR）结合PCR技术可对住院患者血液样本进行检测。T2 MR诊断念珠菌血症的阳性率明显高于血液培养。该系统无需事先进行血液培养及核酸提取步骤，可检测5种常见念珠菌：白念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌。
3.荧光定量PCR分子生物学诊断技术因具有高检出率和鉴定特异性致病真菌的能力而成为许多实验室越来越感兴趣的课题。国外实验室自建方法很多，商品化试剂有待引进和临床验证。荧光定量PCR检测灵敏度高，适用于检测临床标本中低丰度的真菌DNA，对曲霉、肺孢子菌和念珠菌有良好应用前景。需要更多临床验证。
4.基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法 （MALDI-TOF MS）原理是用特异性的多肽、蛋白质谱进行菌种鉴定 。应用范围为报警阳性的血培养瓶检测，真菌结合形态学鉴定 。优势是快速，20min之内即可得到结果，是现有方法中最快的阳性血培养鉴定法。接近100%的高特异性和敏感性。可对混合感染样本的准确鉴定 。
5.宏基因组测序（mNGS）已应用于慢性阻塞性肺病、囊性纤维化、支气管扩张及应用糖皮质激素患者，成功检测到念珠菌、曲霉、隐球菌、青霉菌及担子菌门等真菌。

• 优势：不需要培养，节省时间。相较传统方法（G/GM 试验）可以精确区分物种，甚至亚型，特异性高。在某些类型真菌的检测敏感性高于传统方法，比如曲霉。无需假设目标菌，可覆盖罕见真菌和其他类型病原体。可检测真菌的耐药基因。
• 劣势：对采样要求较高，需要有效采集真菌感染的病灶部位。有的真菌细胞壁厚（如曲霉），有的真菌有坚固荚膜（如隐球菌），破壁困难，核酸不易释放，可造成假阴性；在湿实验流程（比如建库）容易引入环境真菌或试剂中真菌核酸（如灰绿曲霉）的污染，造成假阳性；还有就是真菌基因组数据库不全，很多真菌缺乏全基因组数据（识别不出），且在公开的数据库中真菌序列经常存在人源序列的污染（识别错误）。进行mNGS检测需要注意的是：采集合格的标本，最佳检测标本是 BALF；在技术上改进破壁技术；合理地去除人源背景，提高病原体的检出率；完善真菌基因数据库。
  

6.真菌分子诊断的评价 分子生物学技术具有以下特点：（1）快速，敏感，特异，准确。（2）不需培养，直接对临床标本进行检测，各步骤优化。（3）灵敏度高，但需严格规范操作，避免假阳性。（4）无法区分死菌还是活菌，定植还是感染，需要结合其他诊断方法综合分析。学术讨论

问题1：在标本取材合格的前提下，同时进行两个温度的微生物培养，发现一株曲霉，在25℃培养环境下未培养出，在37℃环境下培养生长。这种情况下如何给临床发检验报告？
答：不是所有的真菌两个温度环境都生长，只有定义为双向真菌的真菌才会在两个温度环境下都生长。有的真菌只在一个温度环境下生长，另外一个温度不生长。临床微生物室用两种温度培养的目的是区分双向真菌。曲霉不是双相真菌，因此不能同时在两个温度环境下生长，仅在37℃环境下培养生长，应报告给临床。
问题 2：临床工作中发现G试验的稳定性不好，这是什么原因造成的？如何解决这个问题？
答：早期的G试验结果确实是不太稳定，经常出现假阳性或者临床反映阳性率太高，主要是因为容易受到污染，G试验在操作的时候，对环境的要求，对实验材料的要求非常高，例如掉进去一粒灰尘，或者在操作的过程中讲话，有唾液等各种因素都会造成污染，污染了就会假阳性。目前建议使用自动化仪器，全封闭全自动操作，这样干扰因素就会减少。
问题3：临床重症患者可能会输注白蛋白，或是使用部分抗生素等药物，影响G试验结果，造成假阳性，有什么方法可以区分G试验结果是假阳性还是真阳性？
答：目前没有方法进行分辨G试验结果是假阳性还是真阳性。但是作为临床工作者必须熟知G试验结果的影响因素，要熟知哪些药物可以干扰G试验结果。
（四）小 结

• 实验室真菌检测检验专家共识指出：①直接涂片镜检：真菌直接涂片简便、快速，能够在各级医院开展，染色镜检可观察其形态学特征（出芽、菌丝、孢子等），对临床诊断具有重要价值，并能判断痰标本是否合格，有利于进行培养等后续检查。②真菌培养：合格标本（无菌部位尤其血培养的临床价值高）经培养后根据菌落大小、形态、颜色可初步判断，并进一步做鉴定和药敏试验。使用显色平板和质谱仪可缩短检验周期，提高准确性。建议：培养+镜检。③非培养方法：实时荧光定量PCR灵敏度高，加上mNGS，抗原（隐球菌荚膜多糖抗原、G试验、GM试验）和抗体检测等，以上真菌检测技术的合理应用（推荐动态检测、组合检测），结合临床病史、症状体征及影像学检查，有助于早期诊断侵袭性真菌病。
• 临床专家对实验室检测的真菌临床意义也有独到的见解：①血清和CSF-GXM是隐球菌病的确诊依据；②血清GM 是粒缺患者曲霉病的诊断依据；③BALF-GM 是侵袭性肺曲霉病最好的检测样本；④血清 G 试验主要针对念珠菌血症；阴性预测价值大。⑤血清曲霉 IgG 抗体，是慢性曲霉病的检测标准；⑥mNGS 主要推荐应用于疑难危重、疑难、特殊感染的患者。⑦无论何种实验室检测方法，都需要结合临床才有意义。
  

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Cxx1998

学习了，辛苦

hejiahui98

一些长期卧床病人也无临床症状，检出胃肠道真菌，是否有临床意义。