【感染科普笔记2024-4-10】探秘病原微生物专栏丨同源性/分型的分子生物学技术

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作者：宁永忠/温海楠审校：蓝雪0816


上一次（https://mp.weixin.qq.com/s/lsB449qfhhCeZvEtOPwp9w）介绍同源性这个词，进而强调了临床微生物学三大作用：辅助诊断、辅助治疗、辅助感控。当然，临床微生物学不止这些作用。比如辅助疾病严重程度判断，这一用途整体上可以并入辅助诊断里；辅助疾病预后判断，这一用途整体上可以并入辅助治疗里；辅助临床流行病学；辅助教学和科研；辅助传染病和抗生素相关管理；辅助生物安全等。在辅助感控里，我们强调了外部比如确定传播链中的传染源、传播途径。也强调了内部，确定体内不同部位同一菌种分离株是否有同源性——这一条国内强调的似乎不多。
同源性角度，提到了定义、场景、常规的底物反应谱和抗生素谱的作用。当时提到，目前国际上以核酸序列（分子技术）为主。
用于同源性判断的分子技术（另一个相似含义的词汇，是分型）有很多种。大家感兴趣可以看一下MCM，就是临床微生物学手册，第11版中译本p160；第12版中译本p170；第13版英文版本p223表2。MCM13p223列了11种之多，还不止这些。这些方法原理各异，特点、成本、流程、繁复程度、结果判断等各不相同。仅仅从文字层面把这些方法弄明白就需要很长时间、一番专研功夫，实际操作就更需要下一番功夫。
作为临床常规工作，可以深入挖掘——爱学习，永远值得鼓励。当然也可以先掌握最基本的、核心的。我的理解，最基本核心的观念如下：①细菌：二十年前，金方法是PFGE；目前常用的是MLST和rep-PCR；目前同源性判断/分型技术的终极是全基因组测序的方法。②真菌：二十年前和目前最热门，同细菌。目前常用的是MLST和STR-MLP。下面介绍几种同源性/分型的分子生物学技术1.脉冲场凝胶电泳PFGE全称是脉冲场凝胶电泳技术的原理是提取微生物基因组（注意是基因组，不是基因，所以要尽量保持完整性），用特定的酶（这个酶的获得和确定，要花一定的科研精力；我们参考权威文献即可）切成片段；片段跑电泳。如果细菌有同源性，跑出来的条带相同。同源性低，则条带差异大。从低到完全相同，条带有逐渐变化。国际上也有专业的判断规则和软件。
这是比较繁琐的分子生物学操作。实验时间要好几天，容易失败。除非是要在英文领域发较好文章，我个人不太推荐这个技术。常规工作遇到的一般的菌株同源性分析判断，不推荐应用，但要知道，它是金方法！
2. 全基因组全基因组这个好理解。全部核酸序列测完，两两比较即可。如果说PFGE的难处之一是有时候条带不够的话，那全基因组的方式正相反，难处之一是判断标准的确定——核酸碱基数量太多。而碱基突变，可以说无时无刻不在进行。严格意义上，就如同没有两片相同的叶子一样，没有两个菌的碱基序列能完全相同。当然这里还有技术问题，比如测序后片段的连接。自己摸索会有一定难度。如果应用，一般是以公认文献为参照。
这个技术（也有很多变种技术）是近年的热点。我个人理解，取代PFGE金方法的地位应该是很有可能。我们拭目以待！
这个技术涉及一定的成本。深度科研，现在已经绕不开这个技术了。常规工作遇到的一般的菌株同源性分析判断，我理解是还用不上。当然如果经费充足，探索新径，也可以尝试。
3. 多位点（指基因位点）序列分型MLST是多位点（指基因位点）序列分型。原理是把若干条保守序列（如管家基因）进行测序，比较序列里碱基突变的情况。这个最大的优点，一是到碱基，足够细；二是很容易标准化——已经可以国际之间进行比较，相对而言PFGE标准化就很难；三是成本低、时间快、技术门槛低。目前细菌、真菌，都可以用这个方法，性能良好。举例如下。
热带念珠菌见文献。[1]该文献题目：多位点序列分型（MLST）分析揭示了意大利和非洲热带念珠菌分离株中许多新的基因型和高水平的遗传多样性。摘要如下：背景：热带念珠菌是一种经常在拉丁美洲和亚太地区分离的人类致病酵母菌。最近研究表明，它在几个非洲和南欧国家也越来越广泛。由于大多数现有的MLST数据来自亚洲，并且没有非洲分离株的基因分型，因此对其全球遗传变异模式知之甚少。目的：为了扩展MLST数据库的等位基因/基因型库，本文报告了从意大利、埃及和喀麦隆不同国家临床来源的一大组热带念珠菌分离株的详细基因分型数据(https://pubmlst.org/ctropicalis，这个网站是国际网站，大家都可以应用)，并探索该物种的遗传多样性。方法：利用为该菌种开发的MLST方案，对103株热带念珠菌菌株进行基因分型。还测试了所有分离株对各种抗真菌药物的体外敏感性，以评估某些基因型是否与耐药性有关。结果和结论：在所研究的MLST基因座中共检测到104个不同的等位基因。在这些位点发现的等位基因多样性显示有51种独特的MLST基因型，其中36种（70.6%）是新的。全局最优eBURST分析确定了18个克隆复合体（CC），并证实了特定的意大利簇（CC36）的存在。三种CC在统计学上也与氟康唑耐药性相关，在喀麦隆和埃及氟康唑耐药性升高。我们的数据显示，我们的分离株具有高度的遗传多样性，这表明人们对热带念珠菌的全球种群结构仍知之甚少。此外，它在意大利、埃及和喀麦隆的临床影响似乎是相关的，应仔细考虑。
金黄色葡萄球菌见文献。[2]我没有选择科研论文，因为这种文章太多了。给大家介绍十年前一篇综述。可以看到十年前，这个技术用于金黄色葡萄球菌，已经非常成熟了。摘要：MLST是一种广泛接受的基于序列的分型方法，它依赖于对编码必需蛋白的相对保守基因的分析。对于金黄色葡萄球菌，MLST提供的鉴别水平足以提供病原体在全球传播的相对详细的情况。该方法对用于获取序列的精确方法没有限制，但分型的方法要求数据具有高质量。已经开发出优秀的基于网络的分析工具和框架。这些工具使得该框架对全球范围的资源进行连续分析与维护，并协助用户分析其数据。
4. Rep-PCRRep-PCR是重复序列PCR方式。成本低，操作和流程简单。对不需要重复检测，不需要外部比较，小范围的内部分型分析很有价值。一般理解，就是短平快先给个初步结论。对于疑似暴发而言，速度至关重要。一方面可能需要采取行动，控制范围；一方面各方面决策需要快速提供证据。没有证据，会有决策焦虑。
5. 短串联重复短串联重复（short tandem repeat，STR）标记的微卫星长度多态性（Microsatellite length polymorphism，MLP）分型，比如耳念珠菌的良好应用。）[3-4]
上述对同源性分析/分型的分子方法，做了最简单概述。大家能记住MLST，就完成了第一步。如果还能记住PFGE、基因组分型、细菌和真菌各自的其他分型方式，那就有了初步掌握了。掌握了这些，对细菌和真菌的体外传播、体内播散的判断，我们就有了强有力的工具。但这个工具，我们目前用的还不够多、不够普及、不够及时。未来加油！
参考文献[1] Dougue AN, El-Kholy MA, Giuffrè L, Galeano G, D Aleo F, Kountchou CL, Nangwat C, Dzoyem JP, Giosa D, Pernice I, Shawky SM, Ngouana TK, Boyom FF, Romeo O. Multilocus sequence typing (MLST) analysis reveals many novel genotypes and a high level of genetic diversity in Candida tropicalis isolates from Italy and Africa. Mycoses. 2022 Nov;65(11):989-1000. [2] Saunders NA, Holmes A. Multilocus sequence typing (MLST) of Staphylococcus aureus. Methods Mol Biol. 2014;1085:113-30. [3] de Groot T, Puts Y, Berrio I, Chowdhary A, Meis JF. Development of Candida auris Short Tandem Repeat Typing and Its Application to a Global Collection of Isolates. mBio. 2020 Jan 7;11(1):e02971-19. [4] Cuomo CA, Alanio A. Tracking a Global Threat: a New Genotyping Method for Candida auris. mBio. 2020 Mar 10;11(2):e00259-20. 相关阅读
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