【感染科普笔记2023-12-28】顾兵丨真菌感染新技术与临床应用

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讲者丨顾兵（广东省人民医院）
整理丨李江慧（河北工程大学附属医院）审核丨吴怀英（聊城市第三人民医院）来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会
侵袭性真菌病具有感染性强、致死率高等临床特点，据统计全球受真菌感染人群数量超过10亿例，其中重症感染患者为1150万，而因真菌感染导致的死亡人数每年约为150万，且危险因素不断增多，重点人群真菌病发生率将逐年增高，真菌病的早期诊断非常重要，在SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会上，来自广东省人民医院的顾兵教授结合案例，详解了真菌感染诊断新技术及临床应用。
一、我国真菌感染概况中国真菌病具有地域差异，马尔尼菲篮状菌病主要发生在中国南部珠江流域，与全球变暖引起的亚热带河流微真核生物群落改变有关；组织胞浆菌病主要分布在长江地区，而且大多为本地病例，输入性病例少。白念珠菌仍是最常见的致病菌，非白念珠菌和丝状真菌不断增加，曲霉已成为重要致病真菌。大量研究发现：真菌病的高感染率与高死亡率的主要原因是缺乏准确、有效的早期诊断措施。
二、真菌感染诊断新技术及临床应用（一）荧光染色技术在侵袭性真菌病检测中的应用原理：通过荧光染料与真菌细胞壁中的己丁脂成分特异性结合，使真菌细胞壁包被荧光，从而可以在荧光显微镜下观察到真菌形态。真菌荧光染色，菌体结构清晰，有利于排除干扰，提高阳性率。
案例一：李××，男，72岁，因“全身瘙痒12年，红斑渗出半年”入院。现病史：患者12年前无明显诱因出现全身瘙痒，早期胸及颈肩部为甚，沐浴后好转，出汗后可加重，夜间为甚，影响睡眠，偶有舌头溃疡，半年前出现前胸、颈肩部及右前臂大片湿疹。既往史：糖尿病，高血压，控制不佳。
治疗方案：进行床边采样。组织革兰染色可见圆形孢子。念珠菌孢子? 隐球菌？粗球孢子菌？孢子结构不清楚，难以辨认。加做六铵银染色，可见褐色孢子，内容物依旧不清楚，无法辨认。加做真菌荧光染色，可见孢囊，怀疑无绿藻可能性大，联系临床医生，伊曲康唑抗感染。培养：小型无绿藻。
（二）质谱技术在侵袭性真菌病检测中的应用MALDI-TOF MS原理：基质吸收激光能量并传递给微生物蛋白质，H+（质子）转移到生物分子而发生电离。电离后的生物分子质量越大、飞行速度越慢，达到检测器的时间越长。
质谱丝状真菌处理流程：耗时长，操作繁琐，整个流程需要1～2小时。进行流程优化，使用双甲酸涂靶法。双甲酸涂靶法在丝状真菌鉴定能力上与乙腈-甲酸提取法接近，优化了前处理实验流程，可应用于临床丝状真菌前处理质谱鉴定。
案例二：主诉：孙××，男，8个月27天，反复发热、咳嗽6天。现病史：6天前无明显诱因出现发热，最高体温38.5℃，伴有咳嗽、有痰，自行予美林口服后体温可降至正常。当天下午出现发热，最高体温为39.5℃，遂于（23/12-28/12）暨南大学附属顺德医院住院治疗，予美洛西林舒巴坦（23/12～26/12）、头孢哌酮舒巴坦（27/12～28/12)抗感染等对症处理，症状无缓解，遂转诊我院。既往史：因35周+早产生后入住NICU，1月大时因肺炎外院住院治疗。2021-12-30 胸片：考虑双侧肺炎。
治疗方案：血培养，怀疑马尔尼菲可能性大，但形态学不见马尔尼菲篮状菌特点，如何鉴定?
马尔尼菲篮状菌数据库拓展流程：菌株收集——测序确认——不同条件培养——质谱鉴定——筛选优质图谱形成参考图谱——聚类分析——特征峰选择——权重赋值——建立超级图谱——正确性验证——特异性验证——重复性验证质谱数据库拓展，弥补质谱本身和形态学鉴定局限性。
（三）ddPCR技术在侵袭性真菌检测中的应用液滴数字PCR(Droplet Digital PCR, ddPCR)：通过大规模平行的单分子扩增实现待检靶分子拷贝数绝对定量。无需对照标准样品和标准曲线，不依赖于CT值来实现绝对定量分析。
传统方法：痛点一：检测周期过长，平均3～5天出报告；痛点二：阳性检出率极低，国内平均低于10%；痛点三：耐药检测需求，难以多位点同时检测；痛点四：动态监控需求强烈，无法绝对定量；痛点N：多菌复合检测、污染等问题。
数字PCR：

• 平均3～5小时出报告；
• 25%+检出率；
• 20多个耐药基因位点，初检时同时检测；
• 绝对定量，开拓动态监控巨大市场；
• 不漏检、全程封闭、避免污染。
  

案例三：青年男性，32岁。主诉：反复发热半年，加重伴咳嗽1月余。现病史：患者自诉2022年4月起无明显诱因出现发热，呈午后发热，午后3点出现体温升高，最高温度39℃，夜间11点出汗后可自行退热，偶有咳嗽，食欲不佳，气促不适，无明显咳痰，胸痛，恶心，呕吐，头晕，头痛不适，外院行胸部CT示：左肺上叶结节，考虑肺结核，予以抗结核治疗方案：利福平+异烟肼+乙胺丁醇，期间发热并无明显改变，服用3个月后患者仍有反复发热。
检测方法：入院后抽取静脉血进行数字PCR检测。马尔尼菲数字PCR阳性——两性霉素B抗感染——第五天血培养报阳——可见菌丝——三天后质谱鉴定：马尔尼菲。马尔尼菲血流感染病死率高，ddPCR相比传统培养能更早发现病原体，为病人争取更多治疗时间。
qPCR检测技术对深部真菌和隐球菌治疗，效果较好。
（四）mNGS技术在侵袭性真菌检测中的应用mNGS一次检测“一群”微生物，不需培养，从临床样品中提取核酸，直接提取临床样本中的DNA/RNA，进行测序，经专用病原数据库比对与生信分析，一次性完成1万多种细菌，真菌，病毒和寄生虫等病原体检测。
案例四：入院病史：患者，男性，58岁，7年前（2014年）我院确诊慢性肾炎综合征、CKD5期，行腹透管置入术并行腹膜透析治疗，现居家规律腹透治疗；4个多月前患者无诱因出现间歇性双下肢不自觉抽搐入院治疗。
院内检查：T 36℃，P 109次/分，R20次/分，BP 128/94mmHg。血常规：WBC 5.36*109/L；NEU 74.2%，LYM 9%，MONO 14.2%，HGB 106g/L，RBC 3.39X1012
炎症指标：hsCRP 8.2mg/L；PCT 0.45ng/mL。感染指标：真菌D-葡聚糖阳性腹膜透析液：呈黄色、浑浊，多形性白细胞增多；双手散在白色皮癣，伴瘙痒，皮肤镜检发现真菌。腹膜透析液送检mNGS。
临床诊断：腹膜透析相关性腹膜炎（真菌可能性大）。腹膜透析液高通量测序，增加破壁处理流程，加大测序深度复测。当天同步再送检另外3家第三方检验公司：公司A: 结果阴性，与实验室沟通并查看测序原始列表后，发现93条球毛壳菌序列。公司B: 结果阴性，与实验室沟通并查看测序原始列表后，发现55条球毛壳菌序列。公司C：检出36条球毛壳菌序列。
治疗方案：予大扶康静滴1周后，改用伏立康唑（02-09）。继续行腹膜透析液培养，02-05日mNGS结果回报后，提示微生物室培养需要延长培养时间，重点关注真菌。培养结果，形态学鉴定：符合球毛壳菌特点。
（五）我们团队研发的tNGS临床真菌检测产品

• 真菌tNGS技术的建立与验证，覆盖60种临床常见真菌。优点：优化破壁方法，提高检出率；通用引物广覆盖；特异引物种间鉴定。
• SERS技术在侵袭性真菌检测中的应用。
  

表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）通过利用贵金属纳米材料基底使得拉曼信号放大108倍以上。近年来，SERS因其快速、无损、高灵敏、指纹谱检测等优点，已广泛应用于核酸、蛋白质、细菌、真菌、细胞、重金属、食品安全等领域。
基于表面增强拉曼光谱（SERS）和正交偏最小二乘判别分析：首次通过SERS指纹图谱鉴定临床白念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌。其次，对毛霉目真菌检测：可将四种（不规则毛霉、灰色小克银汉霉、卷枝毛霉、微小根毛霉）毛霉目真菌准确区分。
小 结顾教授结合临床案例详解了真菌检测新技术及临床应用，使我们熟悉了临床实验室诊断真菌感染的检测方法，但是还需要注意以下节点的融合。

• 真菌实验室诊断技术各有利弊，可与多个真菌检测项目共同联合，构建侵袭性真菌实验室检测平台；
• 非培养技术在真菌检测领域异军突起，但仍需与传统的形态学相结合；
• 临床与检验科需协作配合，合理应用真菌检测技术，明确诊断；
• 真菌检测现有技术与临床诊断需求差距大，急需研发新产品。
  

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LJMX0211

谢谢老师分享，涨知识啦

mjm19900801

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静_cv7ZO

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wuxing718

结合案例讲解真菌感染诊断

hch22959

下载学习，谢谢老师分享！

微笑8

感谢老师分享，认真学习