【感染科普笔记2023-11-2】探秘病原微生物专栏丨别有洞天—1例隐球菌肺部感染引发的微

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作者：卢超翰（佛山市三水区人民医院）
审核：宁永忠/蓝雪0816



一、 病史简介
男，88岁，2023年9月19日因“发热5小时”入住佛山市三水区人民医院感染内科。

• 现病史：患者无明显诱因出现发热，无畏寒，无寒战，伴有右胸部疼痛，偶有咳嗽，无咳痰，病后遂由家属送至我院门诊就诊，胸部CT提示炎症并空洞形成，拟“发热查因”收入感染内科。患者起病以来，精神一般，胃纳一般，睡眠一般，大小便正常，体重无明显改变。
• 既往史：既往诊断“1.社区获得性肺炎-非重症；2.结缔组织病；3.多发性肌炎；4.胆囊结石；5.痛风；6.左肾囊肿；7.前列腺增生”。长期口服“甲泼尼龙”治疗。
  

二、 入院检查
【体格检查】
T：36.4℃，P：96次/分，R：20次/分，BP：101/49mmHg，血氧饱和度：99%。
自主体位，神志清，体型消瘦，对答切题。咽部无充血，双侧扁桃体无肿大，未见脓点。双肺呼吸音粗，双肺未闻及干湿啰音。心界不大，心率96次/分，律齐，各瓣膜区未闻及病理性杂音。腹平软，无压痛，无反跳痛。肝脾肋下未及。肠鸣音正常。双下肢水肿。
【辅助检查】
2023-09-19胸部+全胸廓CT平扫+三维，对比2023-08-18旧片：1.考虑右肺上叶后段、下叶炎症较前有进展；新见右肺中叶厚壁空洞，拟脓肿形成，建议治疗后复查。2.左肺上叶两个纯磨玻璃结节，考虑炎性结节可能，建议定期复查。3.右肺中叶小结节，右肺下叶多发纤维增殖灶，右侧胸腔少量积液。4.胸椎骨质增生；左第7前肋骨皮质欠光整，拟陈旧骨折改变。5.扫及，胆囊多发结石，肝S6囊肿。



图1 2023-09-19全胸廓CT平扫示右肺中叶厚壁空洞
【实验室检查】

• 血常规:RBC:3.47X1012/L,Hb:105g/L,WBC:15.51X109/L,其中中性粒细胞占比95.1%。
• 肝功能:GGT:60U/L，LDH:255U/L,TP:58.9g/L,ALB:28g/L,A/G:0.9。
• 其他化学指标:URE:9.10mmol/L,CREA:50umol/L,UA:286 umol/L,LAC:5.52 mmol/L,GLU:7.82 mmol/L。
• 炎症指标:ESR:91mm/h,IL-6:64.6pg/ml,CRP:70.31mg/L,PCT:0.256ng/ml。
• 呼吸道病毒荧光检测:流感病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒均阴性。
• 结核分枝杆菌检测:涂片抗酸染色阴性；T-SPOT:不确定;Xpert MTB/RIF阴性。
• 血培养阴性，尿常规、登革热抗原抗体、新冠核酸均阴性。
  

三、 进一步诊疗过程

• 2022-09-19入院予哌拉西林钠/他唑巴坦抗感染、甘草酸苷+双环醇片护肝、泮托拉唑钠制酸护胃、甲泼尼龙片抗炎及对症支持治疗。
• 2023-09-22行支气管镜检查，经鼻插镜，镜下会厌及气管内、隆突见少量白色分泌物。双肺1～4级支气管黏膜充血水肿，表面光滑，管腔通畅，见少量白色分泌物，右上叶见一个痰栓，未见肿瘤及活动性出血。吸取痰液后，在右上叶，中叶及下叶行生理盐水灌洗。
  

实验室检查如下：

• 2023-9-22报告血清的G实验：104.16pg/ml；GM实验：0.22；GXM实验：阳性，滴度为1/20。
• 2023-9-23报告炎症指标：SAA:116.94mg/L，IL-6:5.25pg/ml，CRP:87.42 mg/L，PCT:0.0757ng/ml．
• 2023-9-23报告支气管肺泡灌洗液tNGS结果（图2）：细菌：铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、大肠埃希菌；真菌：白色念珠菌；病毒：巨细胞病毒。
• 2023-9-24报告痰培养（S<10/LP,W>25/LP）：铜绿假单胞菌（+++）
  
  
• 2023-9-24报告支气管肺泡灌洗液普通培养、真菌培养阴性；同时肺泡灌洗液的G实验：>600 pg/ml；GM实验：0.64，GXM实验：阳性，滴度为1/20。
  

图2 2023-09-22肺泡灌洗液NGS结果
2023-09-24微生物学实验室收到感染内科反馈该患者血清及肺泡灌洗液GXM均阳性，疑似隐球菌，但培养均阴性，建议再次确认是否有隐球菌生长。实验室收到该反馈后，再次观察培养4天的沙保平板发现疑似隐球菌的小菌落，经涂片初步确认并及时向感染内科反馈，镜下形态见图3。



图3 沙保平板小菌落油镜下藕断丝连的孢子形态
找出原支气管肺泡灌洗液标本进行再次处理并进行涂片革兰染色、墨汁染色查找隐球菌，镜下形态见图4-5。



图4 支气管肺泡灌洗液直接涂片革兰染色镜下疑似隐球菌形态



图5 支气管肺泡灌洗液液化处理后墨汁染色镜下隐球菌形态
同时再次转种沙保平板进行培养，平板生长情况见图6-8。


图6 肺泡灌洗液真菌平板培养第一天菌落形态



图7 支气管肺泡灌洗液真菌平板培养第二天菌落形态



图8 支气管肺泡灌洗液真菌平板培养第三天菌落形态
分纯隐球菌后经Vitek Compact2鉴定确认为新型隐球菌（鉴定率93%）。药敏实验：使用梅里埃ATB真菌药敏试剂盒进行药敏实验，结果如图9。隐球菌药敏根据最新CLSI标准，目前无临床折点，只有流行病学临界值（ECV）。根据ECV值判为野生型或非野生型（野生型（WT）：对检测的抗真菌药物无获得性耐药机制或无敏感性降低的生物型；非野生型（NWT）：对检测的抗真菌药物具有推测的/已知获得性耐药机制或敏感性降低的生物型），本次检出的新型隐球菌为野生型。



图9 新型隐球菌药敏结果
四、 最终诊断
患者老年男性，有结缔组织病基础，长期口服“甲泼尼龙”抗炎治疗，本次因无诱因发热并且门诊CT示肺部空洞入院，结核分枝杆菌检查均阴性，排除肺结核可能。结合血及支气管肺泡灌洗液GXM阳性及支气管肺泡灌洗液真菌培养检出新型隐球菌，故考虑新型隐球菌性肺部感染诊断明确。
五、 讨论和反思
1. 病例讨论：该患者在9-20日送检血清GXM，9-22报告阳性，提示可能存在隐球菌感染，同时9-22临床为患者进行了支气管灌洗同时送检培养+GXM实验+tNGS，24号回报肺泡灌洗液的GXM阳性。由于我院GXM试验仍是外送检测，所以2天后才报告结果，如果该患者的血清GXM在送检当日出具阳性报告，则可以更早提示临床隐球菌感染的可能，临床也能尽早针对隐球菌开展相应检测及治疗。另外，依据GXM试验及真菌培养其实已能明确诊断，tNGS可能也无须送检，从而也降低了患者的检测费用。所以，缩短诸如GXM试验的感染病学检测报告时限，可能有助于及早明确诊断及药物治疗，同时也能减少患者没必要的检查。临床微生物室应尽可能开展GXM试验及G试验，减少报告时限。另外，该患者肺泡灌洗液送检GXM试验及GM试验，同时也送检了G试验。一般不建议对于肺泡灌洗液常规送检G试验，该患者临床可能考虑病情较重故送检。
2. tNGS报告讨论：本案例中，我们关注到支气管肺泡灌洗液的tNGS结果，以下做几点讨论：
（1） 该tNGS在检测结果的细菌栏中，报告了常见微生态菌群，为不太恰当。另外，在查看其完整tNGS的报告中，其在详细检测结果中报告了疑似人体背景菌群，结果如下图。经咨询该检测公司，回复微生态菌群即是疑似人体背景菌群的小韦荣球菌及溶血葡萄球菌。这种解释导致前后概念不一致，易导致解读不明。向该公司建议：在检测结果中直接报告小韦荣球菌、溶血葡萄球菌及其序列数，同时在详细检测结果中注以解释说明即可。



（2） 该tNGS检测将隐球菌及耶氏肺孢子菌等低序列菌株作为“灰区”进行报告，我们认为灰区这概念不恰当，应将低序列菌种一并列到检测结果的相应分类结果中，对低序列结果的解读做一些备注解释即可。简单归为所谓“灰区”易导致临床忽视，特别是对于灌洗液这类非无菌标本，有时候低序列菌株往往指向致病菌。
（3） 该tNGS报告中除了隐球菌检出，同时也有耶氏肺孢子菌及烟曲霉，这种情况应引起足够的的重视。由于我室未开展六胺银染色，因此建议临床请病理科进行六胺银染色镜检查找耶氏肺孢子菌。但是，临床在针对隐球菌进行治疗，患者病情好转后要求出院了，故未进一步排查，目前不明确是否有肺孢子菌感染。对于烟曲霉，由于再次接种培养出的是黄曲霉同时镜检灌洗液涂片时未见真菌丝，同时结合其血清GM<0.5，肺泡灌洗液GM<1.0，故我们考虑污染可能性大。
（4） 该tNGS同时报告了毒力基因及耐药基因，如下图所示，但没有说明具体耐药基因对应的菌种，这导致临床实际应用意义不大。假如临床明确铜绿假单胞菌为致病菌，但是报告没有指明耐药基因具体存在于哪类菌种，那么临床就无法明确是否存在耐药基因了。



（5） 综上讨论，提醒临床及实验室对tNGS报告的解读要谨慎及全面，对于肺泡灌洗液等非无菌标本，tNGS结果可能会误导临床。除此也反应第三方检测公司的检测及报告存在一定不规范情况，急需标准化。NGS尽管作为近几年火热的病原检测技术，也不是完全优于或完全替代传统病原检测技术，两者应是相辅相成。如果没有GXM结果及微生物培养的确认，可能临床就直接忽视tNGS “灰区”处的隐球菌了，从而错失确诊的机会。
3. 微生物实验室反思：微生物学实验室应积极提高自身检出隐球菌的检测能力，既往微生物室一直重视脑脊液的隐球菌检出，但对于肺泡灌洗液甚至痰液的隐球菌可能不够重视，同时在日常工作中光靠培养基的菌落形态发现隐球菌经常也是比较困难的，因为隐球菌的生长较缓慢以及形态接近念珠菌而导致与念珠菌混淆。我们总结的经验是：
（1）首先应提高实验室人员痰液/支气管肺泡灌洗液革兰染色的隐球菌镜下形态特点掌握，对于疑似隐球菌应额外进行墨汁染色或六胺银染色加以确认。进行墨汁染色时应对肺泡灌洗液使用0.1％DTT或者其他专用试剂进行液化处理（DTT只适用涂片，不适用培养），经过液化处理后有助于提高墨汁染色镜检检出率。
（2）对支气管肺泡灌洗液进行培养时，如果有必要，应使用专用试剂进行液化处理，离心取沉渣接种。液化处理有助于消化灌洗液中粘液成分，释放被粘液黏附的隐球菌，有利于培养时隐球菌分离，提高阳性率。
4. 隐球菌常见感染中枢神经系统及呼吸系统，但由于隐球菌感染肺部时临床表现及影像学无特异性表现，导致临床诊断困难，经常误诊为其他肺部炎症、肺结核或肺肿瘤。近年随着微生物学实验室检测能力的提高，隐球菌性肺炎检出率有所提高，也受到临床的重视。但是，在临床工作中仍存在漏诊情况，作为临床医生对影像学异常特别提示肺部结节、空洞的患者应注意排查隐球菌感染可能。微生物实验室检测人员也同样要提高对隐球菌的镜检及阅板能力，日常工作中要特别重视肺泡灌洗液标本，留意有无疑似隐球菌的菌落生长，对肺泡灌洗液标本应进行必要的前处理及适当延长培养时间。
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图文：王小虾

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