【感染科普笔记2023-8-16】马筱玲丨临床微生物检验技术进展

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讲者丨马筱玲(中国科技大学附属第一医院)
整理丨万艳春（江苏省淮安市第一人民医院分院）
审核丨王玉兰（佛山复星禅诚医院）
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染”联合大会

微生物检验在抗菌药物管理（AMS）中发挥着重要作用，这一点在国家各级各类文件中均有所体现。2022年11月2日发布的《临床微生物检验基本技术标准》中明确微生物检验基本技术包括染色技术、显微镜检查技术、接种技术、培养技术、鉴定技术、分子检测技术和免疫学检测技术等。在SIFIC 2022“全国感控与耐药感染”联合大会上，来自中国科技大学附属第一医院马筱玲教授分别从四类基本技术为我们介绍了临床微生物检验技术最新进展。



一、微生物检验技术分类分四大类：染色镜检；细菌培养、鉴定和药敏；免疫学检测；核酸检测。
二、微生物检验技术分类特点（一）涂片镜检：主要是荧光染色技术中华人民共和国卫生行业标准WS288—2017《肺结核诊断》中增加了金胺“o”荧光染色显微镜检查，2022年公布的《侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识》明确指出荧光染色可显著提高真菌镜检的敏感性。目前，人工智能也已经应用到细菌镜检上，如可以显著减少工作量的全自动结核涂片智能阅片机，更高级的真菌AI识别系统已经研发签约。
（二）细菌培养、鉴定和药敏1. 自动化标本接种：从手工接种发展到自动接种仪器，自动接种仪器也已经从单纯的标本“接种”到“接种+培养”再到“接种+培养+鉴定”，已经实现微生物实验室的全自动流程。
细菌鉴定：细菌鉴定从传统的生化鉴定发展到现在的MALDI-TOF检测，其流程简化、时间缩短、鉴定的菌种大大增加（见表1）。
表1 传统与现代细菌鉴定方法比较


2. 快速药敏试验：细菌耐药性检测方法是目前最关注、研究最多的领域。目前分为三类：表型检测技术、分子检测技术和质谱。
第一类是基于表型的快速鉴定技术，已经从肉眼观察细菌生长发展到分光光度自动监测细菌生长光密度，有多种方法可观察细菌生长和活力，其中最具有代表性的方法是“基于单细胞成像分析”，常规微生物检验需要18-24小时完成，而单细胞成像分析只需要3小时观察到变化，6小时可以出报告。目前已经有根据单细胞成像原理研究出的商品化仪器：Accelerate Pheno System（快速成像系统），它包括细菌鉴定和显微镜动态成像的药敏试验，2017年通过美国FDA批准，与传统方法比较有非常好的符合率。还有一种常见方法是拉曼光谱。



第二类快速药敏试验是基于核酸分子技术的细菌耐药性检测，分为单个基因靶点检测、多基因靶点检测和全基因组测序。单个基因靶点检测方法主要应用于临床，而全基因组测序方法一般用于科研。
第三类快速药敏试验是基于质谱技术的细菌耐药性检测，分为3类，分别通过测量细菌的酶活性、通过分析细菌谱峰特征、通过测量抗生素对微生物生长的影响来检测，前两种方法只能检测特殊的耐药机制，不能检测所有的细菌耐药；2021年刚刚发布的“直接靶板微滴生长试验”就是最后一种方法，可以适用于所有的细菌检测。
也有研究推荐血培养报阳肉汤直接纸片法药敏试验，但CLSI研究的细菌种类较少，只有肠杆菌目和铜绿假单胞菌，并且分别针对这两种菌种只检测了6种和4种抗菌药物；而EUCAST研究的细菌种类和抗菌药物检测种类均较多。快速药敏试验是临床迫切需要、实验室需要不断探索和研究的项目。
（三）免疫学检测真菌抗原/抗体检测、呼吸道抗原联合检测。抗原检测方便、快捷、有较高的敏感性和特异性，目前临床常用的抗原检测项目包括细菌、真菌、病毒、寄生虫、非典型病原体和耐药菌检测，近年来研究应用了很多新的敏感性很好的抗原检测试剂，如军团菌（尿抗原）、隐球菌荚膜多糖抗原（CrAg）、碳青霉烯酶检测试剂等。
抗体检测在临床应用并不多，目前主要应用于艾滋病毒（抗体筛查和确证试验）、梅毒筛查、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、EB病毒、麻疹病毒和弓形虫抗体亲和力的检测等。
（四）核酸检测最经典和最传统的核酸检测方法是PCR扩增法，它包括核酸提取与PCR扩增两步操作，程序复杂，对检验人员和环境条件要求较高；扩增采用变性、复性和延伸三步重复循环，一般设置30-40个循环，时间1.5-2小时，只能批量检测，不能标本随到随测。为了应对新冠疫情防控的需要，在我国研发了一步法检测、等温扩增、等温扩增+crispr、高通量等标本可以随到随测、适用于大量筛查的各种核酸检测技术。但单靶标核酸检测在鉴别不同病原体时存在困难，所以研究发展了症候群检测，它是从患者的症状和表征出发，涵盖症候群感染相关的常见病原体组合，一份样品、一次检测就可以诊断或排除多种病原体，显著提高了诊断效率。我国目前有多个症候群检测方法，如呼吸道病原体核酸多靶标检测方法有多种不同细菌和病毒组合，需要根据不同情况进行选择应用；再如血培养阳性瓶细菌鉴定和药敏试验也有多种方法，其中T2Bacteria panel方法可以直接检测血标本，它运用磁共振的原理，敏感性较高，是首个被美国FDA认证（2018年）的直接从全血中鉴定血流感染致病菌的非培养检测方法，但其存在检测靶标较少的缺点。
病原学检测方法比较


宏基因测序（mNGS）可以快速全面鉴定所有类型的微生物，能检测的病原体种类较多，但其技术复杂，影响因素较多，成本较高。而靶向NGS（tNGS）实现病原微生物多重靶向，可以针对呼吸道标本检测188种病原体和9种耐药基因，具有目标捕获能力更强、同时DNA+RNA测序，减少人源背景影响、较mNGS价格较低的多个优点。

• 目标捕获能力更强；
• DNA+RNA测序；
• 减少人源背景影响；
• 价格较低。
  

小 结感染性疾病精准诊断技术发展需要回答临床几个问题：

• 是不是感染？
• 是何种微生物感染？
• 病原体对抗微生物药物敏感性？
  

所以临床微生物检验技术今后发展的需求和方向是新型感染标志物的研发，快速检测平台建设、复杂疑难病原体快速检测、快速药敏技术和直接药敏技术等方面。
《遏制微生物耐药国家行动计划（2022-2025）》也指明了今后发展方向是开展分子流行病学和耐药机制研究、开展临床抗微生物药物敏感性折点研究和标准制定、开展微生物检验技术研发。

封面图片来自网络

图文：王小虾

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