【感染科普笔记2023-8-1】谭德猛丨群体感应调控噬菌体-宿主互作研究

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讲者丨谭德猛（上海市公共卫生临床中心）
整理丨薛彩霞（青岛市黄岛区中心医院）
审核丨蓝雪0816
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染”联合大会

随着细菌耐药问题原来越严重，治疗手段越来越有限，治疗效果越来越差，噬菌体治疗重回人们的视野。上海市公共卫生临床中心谭德猛教授在SIFIC 2022“全国感控与耐药感染”联合大会的演讲《群体感应调控噬菌体-宿主互作研究》介绍了噬菌体-宿主互作研究的最新进展，以便更好地开展感染性疾病的噬菌体治疗。



目前在我们生活的环境如土壤、水源当中，检测出较多的耐药基因，而耐药基因水平的提高加速了耐药菌的产生，也增加了后期临床治疗方面的难度。目前，临床上最常见的耐药菌包括：屎肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌属（ESKAPE）。面对耐药菌的增加，我国也出台了很多政策用以减少或者是禁止预防性抗生素的使用。随着抗生素耐药问题的日益严峻，益生菌、抗菌肽、酶制剂、噬菌体等抗生素替代品也成为了研究的热点，而上海公共卫生临床中心研究所主要围绕噬菌体展开抗生素替代品的研究。



一、什么是噬菌体噬菌体（bacteriophage phage）是感染细菌、真菌、藻类 、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。1896年，英国科学家Erenst Hankin将印度恒河水过滤后发现滤液可以杀死霍乱弧菌，当时他怀疑水中存在一些未知的物质或者病原体在限制印度霍乱流行病的传播中起到关键作用。直到第一台投射电镜的出现，科学家们才发现这种未知的物质正是水中的噬菌体，才清楚认识了噬菌体结构。以裂解性噬菌体为例，其生命周期可以简单概括为：

• 裂解性噬菌体尾丝蛋白与细菌特异性受体蛋白结合；
• 注入自身DNA遗传物质；
• 噬菌体DNA在宿主体内复制；
• 转录和翻译，形成噬菌体“原件”；
• 噬菌体组装；噬菌体利用两种编码蛋白在宿主细胞膜上形成孔洞，降解细菌细胞壁上的肽聚糖，从宿主细胞内裂解。
  

噬菌体的治疗发展较为曲折。在早期噬菌体临床治疗过程中出现了较多失败的案例，主要原因是当时生物技术不够成熟，人们对噬菌体认识程度不够。而与此同时抗生素的发现以及临床治疗效果显著，使治疗的重点转到抗生素上面，对噬菌体的研究几近停滞。而如今随着抗生素滥用问题日益严峻，人们开始重新认识噬菌体，并再次对噬菌体的临床应用进一步进行优化。噬菌体的临床治疗可能比较直观，但是噬菌体和宿主相互作用相对复杂。从进化角度，如果细菌被噬菌体完全裂解掉，噬菌体也将面临繁殖问题。因此，噬菌体和细菌之间应该是相辅相成的，可能是共进化，也可能是共生存。现如今对噬菌体和微生物的相互作用有很多非常前沿的研究：例如CRISPR-Cas、“流产性”感染（Abortive infection）、限制性修饰 (restrict modification(R-M)) 、信号分子系统的调控（Signaling systems）等。



二、 什么是噬菌体库上海市公共卫生临床中心研究所正在建造噬菌体库。建噬菌体库的过程如同剥洋葱，需要一层一层的往下看。
首先，应该研究的就是噬菌体受体。只有搞清楚噬菌体受体并对噬菌体进行分类，才能确定进行噬菌体“鸡尾酒治疗”时，选择不同噬菌体的理由是什么，是基于噬菌体受体，还是基于细菌的理化性质对受体表达的影响。目前已有利用大肠杆菌、霍乱弧菌、海洋弧菌、铜绿假单胞菌等作为“模式菌”，针对信号分子对噬菌体受体的调控作用的相关性研究。在大肠杆菌和海洋弧菌中，发现当菌体密度变高时，噬菌体受体的表达量是下降的。这是因为当菌体密度变高，若噬菌体受体仍然大量表达，会导致细菌更容易被噬菌体裂解。因此，细菌通过信号交流，减少受体表达，以起到保护作用。而在“模式菌”铜绿假单胞菌中却发现，群体感应信号分子可诱导噬菌体受体高表达，即菌体密度变高时更容易被噬菌吸附。这可能是由于海洋弧菌感染模型属于急性感染，铜绿假单胞菌属于慢性感染。另外，研究还发现，群体感应信号分子上调铜绿假单胞菌CRISPR-Cas适应性免疫系统。
其次，溶原性噬菌体和宿主相互作用目前也存在着巨大争议。在Cell的一些研究性文章中提出群体密度变高的时候，它的裂解会更稳定。而在Nature的一些研究文章中则认为溶原性噬菌体感染细菌时，若感染时间变长，更倾向于进入溶原周期。之前在海洋弧菌的研究中也发现群体密度变高的时候，溶原性周期更稳定。可以发现在群体感应和宿主相互作用时存在很多个性，没有很多所谓的共性。因此研究噬菌体时，需要弄清楚受体，再去看群体感应对受体调控的影响。
三、群体感应典型例子溶藻弧菌AP-1（Vibrio alginolyticus strain AP-1）属于溶原菌，食用溶藻弧菌AP-1污染的海产品后，会导致肠炎、消化不良等症状，渔民的伤口被感染后也会出现组织溃烂等。
实验室纯培养溶藻弧菌AP-1，调整浓度至OD值1.0后离心过滤获得无菌上清（有信号分子、小肽、细菌碎片、降解后的细菌遗传物质等），加入一定量的LB培养基后，制备完成AP-1的条件培养液（AP-1 conditioned medium）。将无菌上清、溶藻弧菌AP-1与噬菌体BX-1共培养，通过记录和比较发现无菌上清可以促进噬菌体对细菌的裂解。



如何搞清楚AP-1的条件培养液中的无菌上清的具体成分呢？目前研究比较成熟的是群体感应。群体感应是系统之间的信号交流，最早是从夏威夷的鱿鱼中发现的，也是细菌和宿主共生最典型的例子。夏威夷鱿鱼白天埋在沙子里，它的囊中有费氏弧菌。
当它来到沙子时，会吐出费氏弧菌，但是它囊中仍有部分费氏弧菌，休息一天后，费氏弧菌达到了高密度状态。到了晚上鱿鱼出来捕食，如果有月光，鱿鱼会形成影子，很容易被其他的捕食者发现。但是它囊中的费氏弧菌可以产生生物荧光，生物荧光的光度和月光可以抵消。因此，它在海里面进行捕食的时候是隐形的，大大减少了它被其他的捕食者所猎杀的风险。
研究发现，与群体感应相关的调控还包括：蛋白酶（protease）、毒力因子（virulence）、生物被摸（biofilm）、生物荧光（bioluminescence）、接合作用（conjugation）等。如霍乱弧菌，密度越低，适应性越强，但是菌体密度变高的时候，致病力减弱。还有一些生物被膜，如铜绿假单胞菌在低密度时，生物被膜定植能力比较差，但是在菌体密度比较高时很容易形成生物被膜。
四、群体感应如何调控噬菌体和宿主相互作用为了进一步明确群体感应是如何调控噬菌体和宿主之间的相互作用的，可以从群体感应的代谢通路入手。选取两个极端的例子，一个是低密度状态，一个是高密度状态。低密度状态时，信号分子的量比较少，所以信号分子没有有效的结合到信号分子受体上。这时受体起到了磷酸化的作用，可以将磷酸基团转移到VanU和VanO上。磷酸化后的VanO（VanO-P）可以诱导小RNA 的表达，降解VanT。因此，敲除VanT基因模拟的是低密度的状态。高密度状态时，此时信号分子可以结合受体，并且信号分子的受体会发生构象的改变，呈现出一种非磷酸化的状态。出现VanO失活，对VanT的抑制作用消失。因此，消除VanO基因模拟的是低密度的状态。


因此，基于这个通路我们构建了很多突变体，加入噬菌体以后，发现高密度群体（DluxO），它对噬菌体其实更敏感。低密度群体（DhapR）对噬菌体是耐受的。这个现象是和主流的观点不一样的。主流的认为在海洋弧菌、霍乱弧菌中，群体感应在低密度时，细菌是对噬菌体敏感的，高密度时耐受。



通过克隆技术，测序分析发现在BcsE位点中插了一个碱基可获得突变株（DBcsE），通过实验证实，BcsE基因的突变，参与了细菌对噬菌体的耐受。通过吸附试验再次证明，BcsE基因参与了噬菌体的吸附和噬菌体受体合成。同时通过体外抑菌实验，发现在突变株（DBcsE）中加入噬菌体以后，噬菌体对突变株（DBcsE）的抑菌作用不明显。



文献指出BcsE作用于c-di-GMP信号分子，而c-di-GMP是参与细菌纤维素合成的。细菌纤维素因其具有比较好的组织兼容性而在临床上有广泛的应用。通过在培养基中加入刚果红。如果可以合成纤维素，刚果红可以和纤维素结合。如果不能合成纤维素的时候，颜色可能比较偏向于黄色或者白色。可以判断bcse参与纤维素合成。实验证实，突变株（DBcsE）无法合成纤维素，而纤维素也是噬菌体BX-1的受体。



总结：在群体感应应用方面，我们应搞清楚群体感应是如何调控受体表达的，通过信号分子或者是信号分子突变体来协同治疗，诱导受体表达，从而增加噬菌体的杀菌效果。

封面图片来自网络

图文：王小虾

c陈思s

感谢老师的分享，学习了！