【感染科普笔记2023-7-16】余方友丨非结核分枝杆菌的常规与分子检测

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讲者丨余方友（同济大学附属上海市胸科医院）
整理丨李振欣（辽宁省肿瘤医院）
审核丨秦海燕（昆明市第一人民医院）
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染” 联合大会

来自同济大学附属上海市胸科医院的余方友教授详细介绍了非结核分枝杆菌的分类、特点、流行趋势及不同种类非结核分枝杆菌的鉴定方法和优缺点，以便临床使用中选择适合的检测方法。



一、NTM概述NTM普遍存在于环境中，由于其细胞壁具有较强的疏水性，能天然耐受多种消毒剂、抗生素以及重金属，使其常生存于饮水系统中。NTM可以在很多物体表面形成生物膜从而使其能够抵御外界不利因素，帮助其在自然界或者物体表面长期存活。已经发现的NTM超过190余种，仅少部分与人类致病相关，分疾病来源与非疾病来源。标本采集过程或者实验室操作过程中导致的污染，应正确区别。
二、根据NTM生长速度及产色情况分类

• Ⅰ群光产色分枝杆菌：堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、狼分枝杆菌等。
• Ⅱ群暗产色分枝杆菌：瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌和苏尔加分枝杆菌。
• Ⅲ群不产色分枝杆菌：鸟/胞内分枝杆菌复合群、嗜血分枝杆菌、溃疡分枝杆菌等。
• Ⅳ群快速生长分枝杆菌：偶发分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、耻垢分枝杆菌。
  

三、NTM分类（根据生长速度分类）

• 快速生长型分枝杆菌(rapidly growing NTM)：在固体培养基上培养7天或小于7天，可以获得肉眼可见菌落的NTM。脓肿分枝杆菌复合群（脓肿分枝杆菌脓肿亚型、脓肿分枝杆菌马赛亚型、脓肿分枝杆菌博莱亚型），龟分枝杆菌，偶发分枝杆菌，耻垢分枝杆菌。
• 慢生长型分枝杆菌(slowly growing NTM)：需要大于7天才能在固体培养基上获得肉眼可见菌落的NTM。堪萨斯分枝杆菌，鸟-胞分枝杆菌复合群，海分枝杆菌，蟾蜍分枝杆菌。
  

四、非结核分枝杆菌病特点

• 条件致病菌，易误诊为结核病：环境生长菌，广泛存在于水、土壤等自然环境。
• 引起多器官疾病：NTM肺病(占绝大部分）、淋巴结病、皮肤病、播散性NTM病等。
• 不具有传染性：普遍认为人类从环境中感染NTM而致病，不引起人与人、人与动物之间传播，但近年来发现，在囊性纤维化患者中存在脓肿分枝杆菌人与人之间传播。
• 对抗结核药物多数耐药，治疗困难：TM对一般抗结核药物天然耐药率非常高，误诊为结核病时常导致治疗失败。
  

五、非结核分枝杆菌分布全球各地分离的NTM中，鸟-胞分枝杆菌复合群最多，其次为快生长分枝杆菌；堪萨斯分枝杆菌在南美分离率较高，蟾蜍分枝杆菌在欧洲和北美分离率较高，戈登分枝杆菌在欧洲、北美和南美分离率较高。
中国31个省鉴定出317株NTM菌株(317/4917，6.4%)，其中南部地区共检出287株；NTM感染率因地理区域而异：南部地区的NTM感染率高于北部地区(7.7%vs2.5%)；沿海地区的NTM感染率高于内陆地区(10.7%vs 3.0%)；中国北方和南方RGM与SGM的组成比例存在显著差异；中国沿海地区的RGM显著高于内陆地区。
2013年分离自中国31个省的317株NTM，最常分离的三种占比79.9%：脓肿分枝杆菌复合群(36.0%)、鸟胞内分枝杆菌复合群(34.1%)、堪萨斯分枝杆菌(9.8%)。2013-2016年广州胸科医院分离的607株NTM，胞内分枝杆菌最常见，占28.2%，其次为脓肿分枝杆菌，占23.9%；马赛分枝杆菌，16.6%；鸟分枝杆菌，占16.3%。上海市肺科医院2018年3月-2019年3月分离的NTM中，胞内分枝杆菌最多，占45.49%，其次为脓肿分枝杆菌复合群、堪萨斯分枝杆菌和鸟分枝杆菌。
六、NTM感染的发病率在过去的40年中，一些国家和地区NTM的发病率和患病率呈增加趋势，甚至可能超过结核病的发病和患病率，美国20世纪80年代NTM占分枝杆菌感染的1/3(1.4-6.6/100000)，90年早期已超过2/3,NTM阳性培养物的检出率大约为1.4-6.6/100000；英国2007年和2012年的NTM阳性培养物的检出率分别4.0/100000和6.1/100000；加拿大1998-2002年为29.3个/10万，2006-2010年为41.3/10万。我国NTM占分枝杆菌的比例有上升趋势。上海市肺科医院NTM占NTM培养阳性的大约25%-28%。
我国不同地区或人群NTM感染发生率差异：南方地区、沿海地区、气候温和地区感染发生率较高，感染人群平均年龄较大；北方地区、内陆地区、寒冷地区感染发生率较低，感染人群平均年龄较轻。
七、NTM感染增加的可能原因

• 结核分枝杆菌感染率的下降，潜在地降低了人群对分枝杆菌的免疫力；更多地使用药物会损害宿主对NTM的免疫力。
• 通过家用热水器的更灵活温度设置以及更多接触喷雾气溶胶导致增加接触NTM的机会。
• 在肺部炎症性疾病的治疗中，长期使用抗生素可能会导致有利于NIM生长的肺部生态.
• 某些NTM菌种在特定的人群中(囊性纤维化患者)导致的人与人之间的传播。
• 检测方法的改进和医生意识的增强使NTM感染诊断率增加。
  

八、NTM的易感人群

• 免疫受损/抑制患者：HIV/AIDS、器官移植、肿瘤、生物制剂的使用、免疫抑制剂的使用。
• 慢性肺部疾病患者：囊性纤维化(CF)、非CF支气管扩张、慢性阻塞性肺疾病、肺结核、肺尘埃沉着症、肺间质纤维化、哮喘、过敏性支气管肺曲、霉病。
• 外伤或医源性感染人群：手术器械、注射器具、医疗用水等灭菌不合格或者使用不规范等可导致爆发感染。
• 其他：类风湿性关节炎、低维生素D、低体重指数(BMI)、营养不良胃食管反流病、Lady Windermere综合症。
  

九、NTM不同感染部位的病原体NTM可引起不同部位的感染，最常见的为肺部，皮肤，软组织、淋巴结及播散型也可见，以潮热地带为多见。目前除发现在囊性纤维化患者中存在脓肿分枝杆菌人与人之间传播外，没有发现其他NTM感染在人与人之间、动物与人之间传播。人的感染途径为水和土壤。由于NTM可以短暂、间歇或长期定植在人体的肺部，但不引起感染，在决定哪些患者什么时候需要治疗时造成相当大的困难。
十、NTM肺病诊断标准（影像和微生物指标需同时满足）影像指标：胸片显示结节或空洞性斑片影，或高分辨率CT扫描显示支气管扩张伴多发小结节。微生物指标（至少满足一项）：

• 至少两次留取的痰标本培养阳性。如果结果不具诊断性，考虑重新留取痰样培养或涂片，查找AFB。
• 至少一次支气管冲洗或灌洗液的阳性培养结果。
• 经支气管或其他肺活检查出有分枝杆菌组织学特征(肉芽肿性炎症或AFB)，且NTM阳性培养，或活检显示分枝杆菌组织学特征(肉芽肿性炎症或AFB)，同时一个或多个痰液或支气管冲洗液的NTM培养为阳性。
  

注释：a当培养到少见的或通常代表环境污染的NTM时，应获得专家咨询。对于怀疑有NTM肺病但不符合诊断标准的患者，应进行随访，直到确诊或排除。b根据诊断标准，当获得两次培养阳性结果时，各次的分离株须为相同的NTM菌种(对于脓肿分枝杆菌也可是相同的亚种)。
十一、NTM肺病的检测标本的要求

• 痰、诱导痰、支气管冲洗液、支气管肺泡灌洗液或支气管活组织等，取材创伤小的样本优先选择。尽量在抗菌药物使用前采样，用药患者应停药后2周再采样。
• 口咽拭子不能作为检测样本，因为所含的下呼吸道NTM菌量不够；血清学检测不用于NTM的诊断。
• NTM肺病疑似患者首先取痰液进行检查，若痰液培养阴性，可以考虑CT引导下取支气管冲洗液。
• 标本收集后24小时内进行处理，否则由于其他细菌快速生长影响NTM的检出。若24小时内不能处理应4℃冷藏保存。
  

十二、NTM检测方法抗酸染色或荧光染色：所有的呼吸道标本都应该进行染色镜检检查。优点：简便、快速、价廉、可长期保存。缺点：敏感性低：5000-10000条菌/ml，涂阳检出率低于5%，专业机构涂阳率可达到30%。特异性差，无法区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。无法区别死菌与活菌：结果均为阳性。注释：涂片染色应常规进行，可粗略判断NTM的菌量，尽量使用荧光染色，因为荧光染色敏感性更高。不能仅凭显微镜下细菌形态区别NTM和结核分枝杆菌。
十三、NTM培养注意事项

• 为了避免共生细菌过快生长抑制了NTM的生长，标本需进行去污染处理，常用去污染试剂有：2%的N-乙酰基L-半胱氨酸(Nalc)-氢氧化钠、草酸和1%的N-乙酰基L-半胱氨酸(Nalc)-氢氧化钠。
• 但过长的标本去污染时间会导致NTM活力下降，因此，去污染时间不宜过长。
• 呼吸道标本应同时进行固体培养和液体培养8周，必要时可延长至12周。固体培养的优点是可以观察到单个菌落的形态，及时发现混合细菌的生长，液体培养的优点是缩短培养时间。
• NTM感染高度疑似患者若培养阴性，应考虑更换培养基、改变培养温度、延长培养时间、使用分子生物学方法等，或送参考实验室。
• NTM不同菌种最佳培养时间不同，许多NTM菌种在28℃-30℃时生长最佳，如脓肿分枝杆菌，而有些菌种最佳生长温度为45℃，如蟾蜍分枝杆菌。
  

十四、快速分枝杆菌鉴定方法

• 线性探针杂交(LPA)：专门仪器，操作繁琐。
• 基因芯片法(genechip)：需PCR后处理，容易造成污染。
• 飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)：检测对象为分离株 。
• DNA测序(Sanger sequencing)：不适用于混合感染检测。
  

NTM感染患者分离的NTM菌株需利用分子生物学方法或质谱法鉴定到种，NTM鉴定到种非常重要，因为不同的NTM菌种的耐药谱不同，引起的感染不同，对临床治疗具有指导作用；脓肿分枝杆菌应利用分子生物学方法鉴定到亚型；从疑似人与人之间传播的患者中分离的脓肿分枝杆菌还应进行同源性分析。
（一）鉴定试验MALDI-TOF MS质谱技术作为一种快速的微生物检测技术，能有效的鉴定临床常见快生长以及慢生长的分枝杆菌，上海市肺科医院检验科利用MALDI-TOF MS对分枝杆菌进行菌种鉴定时取得良好效果。

• 鉴定结核分枝枝杆菌到复合群水平的准确性达100%。
• 66%的菌株可以鉴定到分枝杆菌到种水平。
• 29%的菌株可以鉴定分枝杆菌到群的水平。
  

核酸MALDI-TOF MS快速检测结核分枝杆菌复合群及药物敏感性

• 分枝杆菌菌种鉴定与抗酸染色和培养完全一致。
• 结核分枝杆菌菌种鉴定mce3B基因，敏感性达染色体10拷贝，8种药敏的耐药性是检测45种染色体突变。
• 对临床分离株药敏检测中，敏感性和特异性分别为83%和100%。
• 在对临床痰涂片阴性的标本进行结核分枝杆菌直接检测中，核酸MALDI-TOFMS比COBAS方法更敏(61.9%vs.46.6%)，失败率更低(11.3%vs.26.3%)。
  

（二）HRM技术原理及优缺点高分辨率熔解曲线分析(high resolution melting analysis，HRM)是国际上发展的一种新型检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)及扫描突变的新技术，利用一种饱和染料对PCR反应产物进行分析。

• 优点：操作简单，耗时短，成本较低；闭管操作，有效防止污染；可检测未知SNP位点。
• 缺点：对操作人员的要求较高(轻微污染可致假阳性)；对于未知突变，不能确定具体突变类型；对模板质量要求很高，样本不纯会影响结果判读；对荧光PCR仪的温度分辨率要求高；临床上应用较为罕见。
  

（三）多色熔解曲线分析技术（MMCA®）1.熔解曲线(MeltPro®Myco)快速鉴定临床相关分枝杆菌MeltPro®Myco检测是首个基于实时PCR平台的多色熔解曲线分析技术，在单个反应中识别19种临床相关分枝杆菌的诊断系统。整个测定可在3h内完成，且准确率高达99.7%，快速准确，可被用作结核病流行地区的一种筛查工具。
2.MMCA技术的原理及优缺点多色熔解曲线分析技术(Multicolor Melting Curve AnalysisMMCA)基于探针法和熔解曲线分析法，结合多色荧光检测，可同时检测一个反应中的多个待测靶标。

• 优点：操作简单，耗时短；成本较低。单个PCR体系可实现多重靶标的检测，最高可检测72个待测靶标。对已知SNP位点识别特异性高。基于荧光PCR平台，无需额外购买其他专用设备。已在传染病检测、肿瘤检测，遗传病检测，个体化用药等多领域广泛应用。
• 缺点：PCR反应体系较为复杂。无法检测未知SNP位点，需要结合测序确定位点信息。
  

3.多色熔解曲线分析技术——性能评价针对每个菌种，检测限均能达到300杆菌/ml。在相同/不同的荧光通道中，都能检测1%的混合感染。经过Sanger测序验证，对1163株临床分离株样本的检测灵敏度达99.7%(1159/1163)。对94个痰涂片阳性样本进行的进一步检测表明，所有样本均被正确识别(100%)。
4.多色熔解曲线分析技术应用案例（1）中国NTM流行分布研究北京结核病创新诊疗技术联盟组织成立的中国非结核分枝杆菌监测研究组(CNTMS)，包括17家来自全国各个地区的临床单位，共纳入了6766份结果有效的痰样本，应用多色熔解曲线分析技术进行菌种鉴定。其中6236名(92.2%)患有PTB，458名(6.8%)患有NTM-PD，72名(1.0%)患有定植。由北向南，由西向东：NTM-PD的流行有逐步递增的趋势。我国NTM分布区域差异大：胞内分枝杆菌(约占一半)占比随着纬度降低而减少。
（2）中国NTM肺病的比例2019年12月1日至2020年6月30日共6963名抗酸杆菌涂片阳性患者，在6840例结果明确的患者中：74例(1.1%)患者为结核分枝杆菌和NTM混合感染；多数患者(6766例)为单一感染，其中结核分枝杆菌6236例(92.2%)，NTM 530例(7.8%)；458例患者被归类为NTM-pd，而其他72例患者有NTM定殖或污染。因此，在该分析中纳入的患者中，中国6.8%的疑似结核症状患者患有NTM-PD。
（3）中国NTM肺病的分布不同地区疑似肺结核患者中 NTM-PD的比例表现出显著的地理多样性，从西北地区3.2%的疑似肺结核患者，到中国中部6.1%的疑似肺结核患者，以及南方9.2%的疑似肺结核患者。由北向南，由西向东NTM-PD的流行有逐步递增的趋势。
5.PCR+微阵列芯片法核酸提取1小时→PCR扩增仪2.5小时→芯片杂交2小时→芯片清洗及甩干5分钟→芯片扫描5分钟→检测结束，出具报告。整个过程流程所需要小于6小时。
6.DNA亲和层析法脓肿分枝杆菌复合体(MABC)常表现出对大环内酯类抗生素的天然耐药性，对MABC感染大环内酯敏感的亚群进行快速准确的鉴别是临床有效决策大环内酯治疗MABC感染的必要条件。
使用DNA层析法来区分MABC亚种完整的erm(41)基因和erm(41)T28C序列，是一种简单、快速、准确的诊断方法。该方法包括PCR扩增和扩增子检测。
用这种简单的基于DNA层析的方法来区分MABC亚种，完整的 erm(41)和erm(41)T28C序列。单次检测可区分亚种和大环内酯耐药，灵敏度检测限为10pgDNA。
7.NHEJ系统的ku基因(生物标志物)NHEJ系统(原核易出错非同源末端连接系统)的ku基因普遍存在于所有经基因组测序的分枝杆菌种中。
Ku蛋白存在于分枝杆菌种分化之前，是一种参与维持分枝杆菌基因组完整性的重要蛋白，与分枝杆菌的特殊生长阶段有关。它在原核生物中很少见。这些特征使其成为分枝杆菌高度特殊的差异生物标记物。

• 一方面，ku基因作为单基因非测序生物标志物，其特异性引物能有效区分分枝杆菌与其他细苗，MTBC与 NTM，使分枝杆菌的临床检测更加容易，具有很大的临床实用价值。基于ku基因在细菌中的稀有性以及MTBC和NTM在系统发育树上形成的不同簇。
• 另一方面，ku基因序列能在物种水平上有效区分NTM分辨率高。
  

8.免疫组化法免疫组化使用带有红色显色原(碱性磷酸酶)的兔多克隆抗分枝杆菌抗体，聚碱性磷酸酶抗兔IgG用于检测，产生红色信号。观察到杆状生物体的病例被解释为阳性。
免疫组化检测多种分枝杆菌阳性：抗分枝杆菌抗体对禽分枝杆菌(A)、嗜血杆菌(B)、耻垢分枝杆菌(C)、海洋分枝杆菌(D)、褐分枝杆菌(E)、堪萨斯分枝杆菌(F)、麻风分枝杆菌(G)、金黄色分枝杆菌(H)、诺卡菌属(D)具有广泛的反应性。但是，在形态上无法区分物种。AFB阴性对照组未观察到染色。
9.mNGS近期备受关注的宏基因组二代测序技术(mNGS)通过直接测定样本中所有DNA/RNA基因组信息即可实现所有病原菌的鉴定及分型。具备高通量、覆盖度广、速度快、灵敏度高、不依赖传统分离培养、无需特异性引物等优点、
利用mNGS对NTM的47个类型菌株进行了测序，其中快生型分枝杆菌11株、慢生型分枝杆菌36株，同时，重构和分析了41个以前未被描述的NTM物种的基因组，拓展了对NTM的认识。
利用属内的最大似然推理法，串联核心基因组，重建系统发育，发现整个属存在一个共同的祖先，与现在的脓肿分枝杆菌复合体关系最密切。结果与基于16SrRNA序列的系统发育树基本一致。
小 结NTM感染有增加的趋势，但要注意排除实验室污染及定植菌。NTM菌种繁多，鉴定到种困难，常需检测多个分子靶标，质谱技术可快速鉴定NTM菌种，商品化的分子生物学技术可直接对临床标本进行检测。不同NTM引起的疾病特点不同，对抗菌药物的耐药谱不同，治疗方案也不同，对NTM鉴定种，对临床诊断与治疗NTM具有帮助。

封面图片来自网络

图文：王小虾