【感染科普笔记2023-7-12】徐卓菲丨mNGS技术区分呼吸道感染中的定植菌和致病菌

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讲者丨徐卓菲 （探因医学科技有限公司）

整理丨宋慧敏（河南省新乡市第一人民医院）审核丨蓝雪0816来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染” 联合大会

呼吸道是人体开放的腔道，生理情况下含有大量的微生物。发生呼吸道感染时，致病菌可能来自呼吸道正常菌群，也可能来自外环境，造成呼吸道内致病菌与定植菌共存的情况。进行呼吸道标本培养时，培养出的细菌可能是致病菌，也可能是定植菌，给抗感染治疗带来了很大的困难，甚至误导抗感染治疗。mNGS技术可以区分呼吸道感染中的定植菌和致病菌，有效解决这个问题。SIFIC 2022“全国感控与耐药感染” 联合大会上，来自探因医学科技有限公司的徐卓菲教授分享了《mNGS技术区分呼吸道感染中的定植菌和致病菌》，可有效化解这个难题。

mNGS技术的出现和应用

传统的微生物分离培养法检测出来的微生物，有可能是引起感染的病原菌，也可能是定植在人体各器官组织、医院环境或者社区环境中的相关微生物，而mNGS技术在检测微生物遗传物质时，可以进一步鉴定在标本中的已知的或者新发的难以培养的微生物，同时提供相对定量的信息，区分条件致病菌定植和致病的状态。

健康人体的呼吸道存在大量微生物，它的种类和数量具有生境特异性分布属性，呼吸道的不同部位具有不同的理化性质，而且个体之间具有差异化的遗传背景和免疫力。在感染性疾病发生发展期间，人体的免疫会出现快速的变化，某些微生物从条件性健康定植状态快速增值导致感染性疾病。

临床相关的微生物分为绝对病原和条件致病性病原两大类。绝对病原总体数量少，包括但不限于结核分支杆菌、大肠杆菌O157和H7型菌株、肺炎克雷伯ST11 、ST15或者ST23型菌株、狂犬病毒、埃博拉病毒等等。条件致病性微生物种类更多，比如金葡菌、肺克、白色念珠菌、TTV等。

绝对病原、条件致病性微生物以及共生菌之间的关系复杂，比如广泛研究的革兰氏阴性条件致病菌肺炎克雷伯，在公共核酸数据库中，目前已经有两万多个肺克的临床菌株进行全基因组测序，既有低毒力、无毒力菌株，也有典型的高毒力多耐药菌株，比如ST11 、ST23型群株就是高毒力多重耐药菌株。虽然mNGS数据不能像分离纯培养全基因测序提供所有菌群序列信息，但mNGS数据可以提供病灶微生物生境物种谱的组成信息。这些信息可以从分子流行病学、微生态角度提供更多客观、数字化的标准，提示病原生境中不同物种是定植或者是处于致病的状态。

条件致病菌病原风险评估研究

瑞金医院心血管外科团队开展一项回顾性研究：心脏术后肺部感染患者使用mNGS技术与细菌真菌培养技术进行比较分析，mNGS技术为判断条件致病菌和多种病原体是处于定植还是感染提供了一种新的视角。

研究收集了50例心脏术后肺部感染患者，平均年龄64岁，疾病严重程度评分以及实验室结果等临床信息，通过对痰标本进行培养和mNGS检测，结果为：痰标本培养出12种细菌、2种真菌、没有检出病毒。56%的标本没有检出任何微生物；mNGS检测检出680种细菌、58种真菌、21种病毒，60%的标本中检出DNA病毒。结果显示：mNGS技术检测敏感性高于常规培养检测敏感性。mNGS检测可以获得大量的微生物种类，而院检常用的细菌、真菌培养检测法容易受到培养基的种类、培养条件的限制，分离培养出的微生物种类较少，且大部分只能获得一种微生物。

但是需要注意的是，mNGS检测检出的物种是存在于样本中的所有微生物，仍需要进一步的区分与感染相关的病原菌是定植背景菌还是感染致病菌。为了更好的量化标本中的病原风险，探因小组建立了不同微生物物种的检测线和流行指数量化标准，利用这个标准对上述的肺炎感染患者痰液标本微生检验结果进行对比，获得微生物感染危险高风险列表，发现列表中检出的64种细菌、10种真菌和3种病毒。而普通的培养法检出的所有微生物都存在于这个新的列表中，说明这两种检测方法的一致性。但mNGS的量化流程可以弥补培养法不能培养出的或者难以培养出的微生物，能够提供量化的信息，更好的为条件致病菌的治病或定植做出推断。通过微生物群落结构多样性分析发现：在痰培养样本微生物群落的物种组成上，优势病源的种类和分布与临床结局之间没有关系，与其他的临床指标之间也没有关系。优势病原菌会改变微生群的平衡。

肺部感染患者痰液标本微生物VS培养检测筛选的研究亮点：

结合肺部感染患者微生物组数据，建立了病原风险物种丰度谱参考数据库。创新性地提出病原风险量化算法和相应的分析平台，显著提升了区分条件致病菌的定植与致病性的诊断功能。

举例说明量化病原风险应用案例

病原风险分析量化算法的功能介绍：物种相对丰度评估利于检出感染相关的DNA病毒；物种绝对丰度评估利于检出感染相关的细菌、真菌、寄生虫。兼顾临床检验要求即报物种，NTC作为参考可以排除实验室试剂、环境物生物污染。它的优点是：判定阴性标本，排除污染菌和定值菌。

探因小组建立了呼吸道mNGS数据库，可以分别对上呼吸道标本和下呼吸道标本进行量化分析。其中痰液标本有9000多个物种，肺泡灌洗液有1.2万多个物种。特异性数据库可以为相应的微生物群落提供分子流行病学和生态学的量化指标，这些量化的指标可以更好地提示相关的病原风险。比如嗜酸乳杆菌、肠双歧杆菌流行率低，丰度最大值低于5%，说明它的定植属性低。铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌流行率较高，丰度最大值超过90%，说明有致病风险。

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  案例1
  
  患者67岁，脑梗后遗症，二型糖尿病史。在治疗过程中，先给予头孢呋辛经验治疗，在mNGS结果回报之后改为美罗培南，感染指标出现下降，体温逐渐恢复正常，七天后转出ICU，随后好转出院。
  
  常规的mNGS流程从300多个检出的物种中报出9种病原，结合临床，4种以上病原引起的感染不多见。Pra-Q pipeline检出浅黄奈瑟菌，一种革兰氏阴性的条件致病菌，丰度为15%是检测线的1.5倍。另外根据临床关注微生物的列表，报出耶氏肺孢子菌。
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  案例2
  
  70岁的重症患者，有高血压、心肌梗塞、慢性肾病、缺血性心肌病等病史，经验治疗头孢呋辛效果不佳，根据mNGS结果，改用万古霉素联合美罗培南，病情好转，35天后出院。
  
  mNGS流程从300多个检出的物种中报出12种病原，其中很多物种都是条件致病性微生物，包括棒状杆菌、空间螺丝菌、白色念珠菌。Pra-Q pipeline流程从样品中检出了纹帘棒状杆菌，一种革兰氏阳性条件致病菌，检出峰值92%，是检测线得2倍多，通过这个算法有效的把其他条件致病菌筛选。
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  案例3
  
  肺泡灌洗液，mNGS从300多个检出物种中报出3种病原，包括肺炎链球菌、空间螺丝菌和EBV。Pra-Q pipeline流程检出龋齿放线菌。
  
  通常情况下，龋齿放线菌是属于背景生物列表。在这个样品检出列表中，序列最高的两种物种是口腔链球菌和栖口腔链球菌，栖口腔链球菌在数据库中的最高丰度为34%，表明具有定植属性。而龋齿放线菌最高丰度为76%，表明具有感染和致病的潜力。通过这个案例分析表明，序列最高物种不一定是感染相关的病原。
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  案例4
  
  常规mNGS流程报出6种病原，然后通过Pra-Q pipeline流程没有检出任何病源物种，判断为阴性。说明这个样本它是平衡的微生物群落。
  

小 结：mNGS技术是一种新型的微生物检验技术，需要不断积累经验，规范操作，正确使用，同时在临床实践中不断创新，为临床抗感染治疗发挥更大的指导作用。

封面图片来自网络

图文：王小虾

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黄赋颖院感科

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