【感染科普笔记2023-7-12】何军丨讨论mNGS技术在本地化持续建设之路

nionline

讲者丨何军（苏州大学附属第一医院）
整理丨李振欣（辽宁省肿瘤医院）
审核丨江云兰
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染” 联合大会
mNGS技术的普及和发展离不开基础技术平台的构建和发展。来自苏州医科大学附属第一医院的何军教授从申请流程、场地设置、人员培训、技术流程、室间质控等方面细致详尽的向我们介绍了mNGS技术平台本地化建设的流程和注意事项。并强调为保障mNGS技术本地化持续发展，应重视实验室内部和实验流程的质量控制，注重人才培养和科技成果转化，加强临床沟通，走好专科化、特色化道路。不断提升社会和经济效益价值。



一、讨论mNGS技术在本地化持续建设之路mNGS是一种宏基因组基因测序技术，在建设过程中开展经验分享，为大家在今后工作中有所启发。我国2018年开始建设平台，2019年、2020年开始发表一些研究成果。不同领域专家共识不断增加和日益完善。
二、建设mNGS技术平台在本地化开展的优势

• 采集样本的规范化根据临床需求，可同时采集不同感染部位或途径的样本。
• 降低运输风险减少标本运输过程中带来的生物安全问题。
• 缩短报告周期节约物流及沟通时间，对临床需求快速反应。
• 提高解读能力充分高水平传统微生物检定经验，可以促进mNGS病原体报告的精准审核，结果解读及临床沟通。
• 促进学科发展1）促进传统病原微生物培养、血清学诊断、PCR分子检测等技术人员水平与检验质量的提升；2）促进医院多个感染相关临床科室发展，提升临床诊断水平，学科及人才队伍建设；3）优势最大化，建立本地化数据库、样本库，严格质控，精准解读，助力临床诊断。
  

三、建设mNGS技术平台院内开展的申请流程

• 项目前期调研及评估→向医院职能部门提出开展新技术申请→获批后由职能部门开展相关招标工作→组建实验室建设（实验室建筑设计、装修、设备、人等）。
• 建立项目性性能确认方案→完成实验室操作、数据库评价、生信分析性能确认→完成项目性能确认报告、完成标准实验操作规程及相关记录表格的书写及设计→完成人员培训、实验室内外对比测评。
• 在医院内部召开临床沟通会（重点学科全覆盖）→医院职能部门审核：收费价格、医保比例、信息对接、报告发布→标本采集的培训及发放标本容器→在医院内网公布项目开展通知及相关事项。
  

四、mNGS技术本地化开展的基本要求

• 场地资质：面积、资质（备案）、人员（证书）。
• 设备平台：测序仪、数据库、分析软件、其他配套设备。
• 人员要求：实验室人员技能、生物信息分析人员、结果报告解读、临床协调。
• 试剂耗材：试剂种类多、质量评估、专用（文库、测序、耗材）。
• 技术流程：标本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序、数据库更新。
• 管理制度：标准化操作、室内质控标准化、室间质控对比、临床与科研提升。
  

五、实验室场地设计的建议（一）场地设置建议

• 试剂准备区：试剂分装；
• 样本制备区：核酸提取；
• 文库构建一区：文库制备、接头标签；
• 文库构建二区：文库纯化、文库质检；
• 测序区：上机测序；
• 电泳区：过程质检；
• 单向流设计，切勿逆行。
  

实验室场地设置必须按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的相关规定开展临床mNGS。检测实验室应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作指导》的相关规定。同时，有相应的专业技术力量：人员、仪器、技术、相关的实验室资质（PCR实验室资质、NGS试点单位资质等）。
（二）测试平台及配套试剂


（三）人员要求实验室应该配备满足开展平台检测要求的医学、检验、生物信息学等专业人员。

• 实验室人员：参加相关培训并取得国家相关证书，如：国家基因扩增检验实验室技术人员岗位培训合格证书（感染类）。
• 生物信息分信息人员：掌握mNGS检测原理及生物信息软件，具备数据信息维护及管理，开发新算法及更新数据库的能力。
• 报告解读及报告签发人员：具备临床医学、微生物学和分子生物学背景，掌握相关临床诊疗指南。
  

（四）技术流程-实验操作

• 样本采集：①严格的无菌技术，将污染的可能性降至最低。②采取适当的采样位置和技术，推荐采集感染原发部位的样本。③正确选取采集/储存容器，容器均为一次性使用，且保证无污染。
• 核酸提取：去除人源细胞。
• 核酸抽提及文库建立：文库制备流程中需要对每次提取的核酸样本进行样本定量检测，以确保核酸质量。
• 上机测序。
  

（五）技术流程-结果分析碱基识别→数据质控→去宿主序列→病原数据库对比/耐药数据库对比→病原鉴定/耐药鉴定→报告解读。
注意事项：①建议测试序列读取长度不少于50bp，有效测序数据量不低于20M。②推荐使用临床应用级别的数据库，病院数据涵盖细菌、真菌、病毒、原虫等多种病原菌微生物。③剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息。
（六）室内质量控制

• 核酸总量及纯度：影响病原的检出，易受背景菌的影响。
• 文库总量：影响病原的检出。
• 插入片段长度：过大（破碎异常），过小（基因组降解）。
• 扩增比例：比例异常提示标本质量差或文库构建失败。
• Q30：衡量测序准确度。
• Clean Reads：高质量数据低影响病原检出。
• Pathogen Reads：提示样本中微生物含量。
• 参考品：内参和外参（阴性和阳性）。
  

（七）室间质量评价2020年国家卫生健康委临床检验中心组织开展mNGS室间质评工作，旨在评估mNGS敏感性、特异性，报告解读及近缘物鉴定等能力。
六、保证mNGS技术本地化持续建设的保障

• 实验室全流程关键点质量控制样本采集：采集时间、部位、样本量、状态、运输温控。核酸提取：总量、纯度、浓度。文库构建：文库总量、片段分布、扩增比例。上机测序：读长、数据量、测序质量。生信分析：Clean Reads、Pathogen Reads、阴性对照。结果解读：序列数、覆盖度、相对丰度。
• 实验室内部关键点质量管理人员：员工培训及能力验证。仪器：新仪器验证、使用中仪器验证、年度校验。试剂耗材：性能验证、背景菌验证。环境：温湿度、防污染措施。方法、文件：操作步骤规范化、方法学的更新及完善、关键点的质量控制、完善实验流程记录。
• 有效、不断召开临床沟通会：专科化、特色化发展。
• 科研成果是持续发展的动力。
• 社会和经济效益是持续发展的价值体现。
• 培养综合性人才是难点。
  

分析mNGS检测结果，能结合其他实验诊断，临床诊断和治疗信息，给予临床提示性结果的综合性人员；具有能与临床沟通、合作，发现新的诊疗手段，凝练以临床为导向科研方向的综合性人才。
小 结：随着mNGS技术的不断完善，院内外机构合作，在本院开展mNGS技术检测感染性病原体的时机已非常成熟。应重视实验各环节的质量控制，最重要的还是样本采集的时机和标本类型、操作人员的实验技能、完善的数据库、技术方法的不断更新。提高检验人员从事并能熟练掌握生信分析的能力及水平，充分利用实验数据及临床资料，善于发展问题并不断解决问题，实现mNGS技术对感染性病原体精准诊断和治疗价值。重视与临床的沟通和合作，定期召开临床沟通会，善于总结及提升对临床病例的分析能力，才能使该项目在院内持续发展。

封面图片来自网络   图文：王小虾