【感染科普笔记2022-11-21】马筱玲丨mNGS专家共识解读及本地化应用

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马筱玲丨mNGS专家共识解读及本地化应用https://mp.weixin.qq.com/s/TytVtIpl8EL5HC25Xrqf8Q

讲者丨马筱玲（中国科技大学附属第一医院）

整理丨陈维（成都市新都区人民医院）审核丨江云兰（安徽医科大学附属安庆第一人民医院）来源丨2021年SIFIC全国感控与耐药感染大会

编者按

感染性疾病是威胁人类生命健康的主要疾病，病原学诊断是感染性疾病诊治的关键环节。近年来，宏基因组二代测序技术(metagenome next generation sequencing， mNGS) 迅速发展。与传统病原学检测技术相比，mNGS 能无偏倚性直接分析出标本中的病原体谱、丰度和分布情况，改变传统病原学诊断模式，具有良好的应用前景。2021年第五届东方耐药与感染大会上，中华医学会检验分会中青年委员马筱玲主任结合王辉教授牵头撰写的宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识，对专家共识中mNGS在病原体检测、检测关键环节及解决方法和本地化应用等方面进行讲解，促进mNGS技术合理应用。

01
为什么要用mNGS？临床病原学诊断的常规方法有镜检、培养、抗原/抗体检测和 核酸检测。传统方法均以预测微生物来选择检测项目，病原体诊断与临床预先判定病原体、选择正确的检验方法以及标本采集送检、微生物培养等密切相关，依赖传统方法约有25%～60%的感染性疾病病原体不能明确诊断。
二代测序技术( next-generation sequencing，NGS) 是相对于一代测序技术而言的新型测序方法，可以同时测定几百万甚至上亿条核酸序列，其优势是通量高、敏感性高。在微生物检测中，NGS 技术可用于宏基因组测序、全基因组测序、转录组测序、目标基因测序等。宏基因组二代测序( mNGS) 技术指采用NGS技术对特定标本中所有核酸序列进行测序。mNGS能全覆盖检测细菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次体、真菌、病毒、和寄生虫等所有病原体。
常规微生物检测不能获得病原体或急需获得病原学结果时可开展mNGS，mNGS技术主要检测适应证如下：

• 根据临床表现，不明原因发热或发热症候群、急危重症全身感染或局部感染（如中枢神经系统感染、骨关节感染、重症肺炎）、免疫受损患者疑似继发感染、经验治疗效果不佳的慢性感染；
• 根据微生物学，疑似新发病原体，或某特殊病原体、怀疑2种以上病原体共同感染；
• 根据流行病学，聚集性感染爆发，感染性疾病患者有特殊区域（如北美地区）旅居史，或有特殊职业工作史（如畜牧业、屠宰业、水产业等）。
  

02
mNGS检测关键环节及解决方案mNGS 检测灵敏度是指单位体积标本中检测到1条病原体序列所需要的病原体个数。需要的病原体个数越少，则灵敏度越高。mNGS 检测灵敏度与测序数据量（检测总序列数) 及致病微生物基因组的碱基数呈正相关，与单位体积标本中人源细胞含量及背景微生物基因数呈负相关。所以，提高mNGS灵敏度的有效方法是增加测序数据量、增加病原微生物基因、采取适当的方法去除人源性细胞、减少环境和试剂中的背景微生物等。在测序数据量确定的情况下，可通过以下因素影响mNGS检测灵敏度：

• 提高病原微生物核酸。病原体载量越高、病原体基因组越大（寄生虫>真菌>细菌>病毒）、核酸提取效率越高，病原微生物核酸片段数（检测reads）越多。
• 减少背景微生物的影响。背景微生物主要由定植和污染微生物组成。污染微生物主要由标本采集、核酸提取、建库测序引入，所以在标本采集时应严格无菌操作，在提取过程中应全过程有防污染措施，在建库时慎用各种扩增方法，扩增方法会使正常菌群或污染病原体的序列扩大，难以判断真正的病原体。
• 减少人源核酸。标本保存需添加核酸稳定剂、冷链运输标本，高宿主背景需去除人源性细胞。
  

03
mNGS本地化应用优势mNGS能无偏倚性检测各种病原体，弥补了传统病原学检测方法的不足，mNGS检测本地化能够减少检测周转时间、标本及时转运能够减少细胞破坏溶解，减少人源背景、实验室能够与临床进行沟通交流，选择/补充测序方法、实验室建立自己的背景微生物数据库、阈值等，报告结果能够更及时准确。
感 悟“共识”使mNGS检测更规范；“技术”使mNGS应用更可及；“本地化”使mNGS结果报告更及时准确。马筱玲主任深入浅出的对mNGS在病原体检测、检测关键环节及解决方法和本地化应用等方面进行授课，为大家今后做好感染性疾病病原学诊断工作提供了值得借鉴的管理经验和宝贵的工作思路。
图文：王小虾

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