第十三期 探秘病原微生物专栏丨临床微生物学助力精准感控——同源性技术

小雨飞飞

目前正值新冠流行期间，讨论感染性疾病的传播，是一个很有时代感的话题。不过对于微生物学、对于感染性疾病控制和预防专业来讲，这是老话题了。

人类出现伊始，不知道某些疾病是可以传染的。是一次一次瘟疫，让人类逐渐意识到一部分疾病可以传染。东汉许慎《说文解字》里的“疫”，解释为：民皆疾也。生动体现了短时间内一批人得相同疾病的特点。这是从临床表现上，得出来传染的客观规律。

随着医学的进步，医学专业人员意识到，表现相同/相似的疾病其病因不一定一样。对感染性疾病而言，确定传染与否，临床表现不再是唯一依据，而是成了依据、条件之一。更本质的是微生物——导致感染性疾病发病、传播的微小生物。

林奈“种了一棵树”之后，直到今天，微生物的种、属概念成为了常识。导致相同感染病传播的微生物，一定是相同菌属的相同菌种。不同菌种引起的感染，我们已经判定为不同的感染病了，哪怕临床表现一样。这让传染病的病因判断、传播判断，从宏观到了微观，更细化了！这种变化这符合科学的发展规律。人类认知的规律，就是越来越细。

微生物学也有一百多年历史了。在微生物种属之后，人类试图进入到更加精细的范畴。于是我们有了“同种不同株”的观念。而且这个观念，因为化学反应、分子生物学技术等而逐渐“实在”起来！

概括一下，确定传染性、确定暴发，需要致病的微生物有同源性！甚至是一个克隆！种属相同的基础上，同源性一致——即鉴定的化学反应、药敏试验结果、分子生物学判断，甚至噬菌体分型、某些蛋白质分型等一致。

从技术层面，有两方面问题需要关注：

• 一方面，是鉴定的化学反应、糖同化反应、常规药敏试验等，一度是同源性判断的依据，而且有成功案例。这一条很重要。因为今天主要依靠分子生物学时，它们依然有价值。两个分离株的生化模式、药敏模式差别很大，肯定不是同源的。亦即，可以反之思考判断，否定同源性。现实中，有时候精通分子生物学技术的人员，却不知道简单表型的意义，偶尔会误入歧途。常规工作同仁也不知道简单表型的意义，常常望“洋”兴叹。
• 另一方面，就是分子生物学技术。神奇的新冠疫情，让全民都知道了核酸，很多知道了PCR。分子生物学里的分子，简单理解就是核酸；分子生物学技术，最常用的就是PCR（聚合酶链反应）。而判断同源性的分子生物学技术，有很多种。具体见《临床微生物学手册》第12版（MCM12）第11章。
  
  

我个人欣赏的技术，是MLST（多位点序列分型）。它针对多个管家基因（就是保守基因），扩增测序后，核苷酸水平比较彼此的同源性。技术简单而有一定分辨率，高度可重复，客观可比较。一般性工作需要，如果文献资料成熟、技术条件具备，可以直接用。具体见早期PNAS文献。[1]早期的MLST，比较五、七条基因，十来条，就是一般提到的核糖体MLST，传统MLST。此时，管家基因不变，即认为同源。当然，此时细菌其他基因组分的突变尤其是质粒的获得或丢失、引入较大的插入片段等，会引起具有同源性的菌株的化学反应、耐药性或某些表型有一些差异，不是百分百一模一样。

MLST技术逐渐发展，一直到目前的基因组时代，有很多变化。基于传统MLST，后来逐渐发展出针对几十条基因、数百基因、数千基因乃至全基因组的序列分型。其中两个特化类型，是核心基因组MLST（cgMLST，数千条）、全基因组（wgMLST，基因组整体）。wgMLST提供了足够的分辨率，适用于短期疾病暴发的调查（就是前面所说同源性判断）；cgMLST则提供了长期稳定性，适用于菌株种类命名。到这里，似乎有一点循环往复的味道：同种的前提下，用MLST进行分型、确定同源性；而cgMLST反过来可以确定菌种。循环往复，螺旋上升。另外，也有cgMLST终结传统MLST的观点。[2]个人觉得，传代MLST技术有其灵活方便之处，短期内肯定会继续适用的。

相比而言，PFGE（脉冲场凝胶电泳）一直是金标准（MCM12第11章表11-2依然这样评价），但操作过于繁琐，容易失败；而且很难纵向、横向大范围比较（可大范围客观比较，是MLST的优势）。而WGS（全基因组测序）一般是依赖于合作方完成，主体没有参与感，也比较昂贵，数据量大，不好分析。如此种种，是我欣赏MLST的缘故所在。当然，我们对WGS充满期望，未来它也会更加实用。

MCM12第10章《疾病暴发调查》、第11章《分子流行病学》，为我们今天的话题提供了足够的背景、场景和细节知识。反复阅读，可以获得关于同源性技术的丰富知识。期待各位一阅。

综上，人们关于病原微生物的同源性、克隆性的观念逐渐深入细化，而支撑的技术（如MLST）也愈加进步、丰富。技术像河流，观念像河床——水势大了，河床自然会更深、更宽、更远。

参考文献

[1] Maiden MC, Bygraves JA, Feil E, Morelli G, Russell JE, Urwin R, Zhang Q, Zhou J, Zurth K, Caugant DA, Feavers IM, Achtman M, Spratt BG. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Mar 17;95(6):3140-5. doi: 10.1073/pnas.95.6.3140. PMID: 9501229; PMCID: PMC19708.

[2] Kimura B. Will the emergence of core genome MLST end the role of in silico MLST? Food Microbiol. 2018 Oct;75:28-36. doi: 10.1016/j.fm.2017.09.003. Epub 2017 Sep 8. PMID: 30056960.

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