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施毅丨真菌感染实验室诊断，到底该信哪个“G”?https://mp.weixin.qq.com/s/wM9Y5U8o8tr_MoTeDiWkDA
讲者丨施毅（南京大学医学院附属金陵医院）整理丨孔晓明（江苏省溧阳市人民医院）责编丨蓝雪0816来源丨2021年全国感控与耐药感染大会
真菌感染是一个永恒三角，涉及宿主因素（遗传、免疫反应、微生物组学）、真菌因素（毒力、耐药性、适应性）和环境因素（暴露、健康护理、气候）。在临床实践中，真菌感染的诊治较为困难，其中真菌病原学检查是临床诊断和确诊的金标准。2019 EORTC/MSGERC新共识延续2008版分级诊断原则：确诊、临床诊断及拟诊。其中拟诊：仅1项宿主因素、1项临床标准符合，但微生物学标准不符合；临床诊断：患名需符合1项宿主因示、1项临床标准和1项微生物学标准；确诊：无菌部位标本的真菌镜检或培养阳性等提示真菌感染。真菌微生物学诊断方法也在不断变迁，在疑似感染患者中主要通过临床标本的常规检测如涂片镜检和培养(Al)、生物标志物如1-3-葡聚糖(G)和半乳甘露聚糖抗原检测(GM)(AIl)、分子生物学如PCR对真菌DNA扩增(All)和基因测序(mNGS)获得的诊断。施毅教授从目前真菌实验室检查中存在的问题及如何正确解读检查结果出发，详细的从真菌感染临床诊疗思维，逐个分析了GM试验、G试验、特异性IgG抗体、mNGS检测技术的原理、诊断思路、干扰因素以及临床真菌感染诊断中的价值。
真菌感染的永恒三角
真菌实验室检查现状真菌实验室检查中我们存在哪些问题?- 能够开展哪些真菌实验室检查?（非常有用但没有开展的检查）分泌物涂片、镜检与培养——做不好分泌物或血清抗原检测——开展不足血清抗体检测——很少开展分子生物学检测：PCR，mNGS——过度检查
- 能够正确地解读检查结果吗?（非常可靠的结果解读有误 ）微生物培养阳性就是感染?血清抗体检测真菌感染的价值如何?血清GM试验阴性就可以排除真菌感染?mNGS序列数很高就是感染?
几项真菌实验室检验项目比较一、曲霉半乳甘露聚糖抗原检测-GM试验- 半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)是曲霉生长时分泌的一种多糖抗原标记物，是早期感染的指标。GM试验是严重免疫抑制/粒细胞缺乏患者侵袭性曲霉病（IA）的有效诊断工具。
- 2016 IDSA曲霉病指南和2019欧洲指南均排荐使用血清、支气管肺泡（BALF）、血浆和脑脊液 GM的监测诊断侵袭性曲霉病。也指出抗真菌药物会影响GM检测的敏感性。
- 非粒缺患者血清和BALF样本GM试验研究结果显示：血清GM试验对严重免疫抑制/粒细胞缺乏患者IA敏感性好；BALF GM在免疫抑制/非免疫抑制人群中敏感性都要明显好。
- GM试验干扰因素：（1）GM试验假阳性因素：阿莫西林/克拉维酸、头孢吡肟、头孢哌酮/舒巴坦、头孢曲松、碳青霉烯、亚胺培南/西司他汀；其他侵袭性真菌(青霉、镰孢霉、组织胞浆菌、皮炎芽生菌等)感染；新生儿双歧杆菌定植；多发性骨髓瘤患者（2）GM试验假阴性因素: 非粒细胞缺乏患者、慢性肉芽肿
- GM试验在临床真菌感染诊断中的价值：（1）GM试验在侵袭性曲霉病(IA)中有重要的临床诊断意义，尤其在粒缺患者中，血清GM试验的意义重大；（2）预防性或前期应用抗霉菌治疗明显降低血清GM试验的诊断价值，非粒缺患者血清GM试验敏感性明显下降，阴性不能除外感染；（3）非粒缺或预防性应用抗曲霉治疗患者推荐使用 BALF GM试验，此时不同标本检测GM试验的阈值不同；（4） GM试验新的临床阈值：单次(血，BALF，CFS):>1.0；同时检测：血清:>0.7，BALF:>0.8；（5）GM试验的动态监测，可以反映治疗的疗效， GM 检测有一定的影响因素。
二、(1-3)-β-D葡聚糖检测-G试验- G试验是以真菌细胞壁特有的(1-3)-β-D葡聚糖为标记物的检测方法。G试验为泛真菌检测。G试验能检测的真菌类型：念珠菌、曲霉、耶氏肺孢子菌、毛孢子菌、镰刀毒、支顶孢霉等。G试验不能检测：隐球菌、毛霉(根霉、毛霉、根毛霉、犁头霉、小克银汉霉等)。国内外指南推荐应用G试验诊断侵袭性念珠菌病。
- G试验的干扰因素：干扰因素更多，结果解读应谨慎
- G试验假阳性因素：包括① 纤维素膜（含葡聚糖成分）进行血液透析；② 血液制品（白蛋白、凝血因子、免疫球蛋白等）；③ 抗菌药物（磺胺类药物、阿莫西林/克拉维酸、多粘菌素、厄他培南、头孢唑啉、头孢噻肟、头孢吡肟）；④ 细菌菌血症（革兰阴性杆菌）；⑤ 黏膜炎或胃肠黏膜受损；⑥ 手术时应用的纱布或海绵（含葡聚糖成分）；⑦ 抗癌药物 (含葡聚糖如香菇多糖) 。G试验假阴性因素：包括① 隐球菌和毛霉感染；② 抗真菌药使用。特别需要提请大家关注的是G试验检测试剂盒的质量问题，国内试剂种类众多，质量良莠不齐，判定标准不一，临床应用价值令人担忧，结果解释更需谨慎。
- G试验在临床真菌感染诊断中的价值：（1）G试验在IFD诊断中有重要的临床诊断意义，尤其在除隐球菌和毛霉外的多种真菌感染，为国内外指南所推荐；（2）G试验是早期检测方法，先于临床症状 4天，早于发热 5天，早于呼吸道症状 11天，血培养报阳前 10天内呈阳性；（3）目前只认可血清G试验检测，可在1.5-2小时内快速得出检测结果，但目前试剂盒众多，阈值不一，解读时应谨慎；（4）对于念珠菌血症, G试验是首选检查方法；对于肺孢子菌感染也有很大的价值，但干扰因素较多；（5）对于是否停止侵袭性念珠菌感染高危患者的经验性抗真菌治疗有重要参考价值。
三、血清曲霉特异性IgG抗体监测- 欧洲（ERS-ESCMID）慢性肺曲霉（CPA）诊断与治疗指南（2015年版）推荐曲霉特异性IgG抗体检测（对有空洞或结节的CPA）为A级（最高推荐等级）微生物诊断标准。
- 中国变应性支气管肺曲霉病（ABPA）诊治专家共识（2017年版）推荐，诊断ABPA必须具备第一项、第二项和第三项中的至少2条；其中第二项为必需条件：①烟曲霉特异性IgE水平升高，或烟曲霉皮试速发反应阳性；②血清总IgE水平升高。从诊断标准中可见，通常我们认为最为重要的曲霉培养阳性和GM试验反而不是诊断的必备条件，说明曲霉特异性IgE抗体检测在ABPA诊断中的价值。
- 血清念珠菌抗体检测在真菌感染（IC）诊断中的意义：目前已经应用于临床的抗体有：①抗念珠菌烯醇化酶IgG抗体（anti-Eno IgG）；② 抗甘露聚糖（mannan antigens，Mn）抗体，可以与甘露聚糖抗原（Mn）联合检测；③ 抗念珠菌果糖二磷酸醛羧酶（Fba1）抗体；④ 抗白念珠菌芽管抗体（CAGTA）。抗体检测的意义：IC早期快速诊断；区分念珠菌的定植与感染；与其他真菌无交叉反应；联合检测可以提高阳性率。
- 真菌抗体检测的干扰因素：曲霉IgG抗体检测的干扰因素：包括① 组织胞浆菌、球孢子菌感染交叉造成假阳性，但是报告例数不多；② 血液制品，免疫球蛋白治疗造成假阳性，但是一般阳性数值会很快下降；③ 抗真菌药对抗体影响：小于抗原，但长期抗真菌治疗还是可对抗体浓度造成影响。念珠菌抗原、抗体检测的干扰因素：包括① 念珠菌Mn试验假阳性的影响因素：抗病毒药物阿昔洛韦、伐昔洛韦；② 念珠菌IgG抗体假阳性的影响因素：丝孢子菌、隐球菌交叉反应造成假阳性，血液制品，免疫球蛋白治疗。
- 血清真菌特异性IgG抗体包括在临床真菌感染诊断中的价值：（1）血清曲霉特异性IgG抗体包括在曲霉球、CPA诊断中是最重要的微生物学证据；（2）血清曲霉特异性IgG抗体包括可以用于监测抗曲霉治疗的疗效，有助于区别定植与感染；（3）曲霉抗原抗体联合检测，能覆盖更多的曲霉感染人群，对IPA也有一定的辅助诊断价值；（4）曲霉特异性IgE是ABPA诊断的必备条件；（5）血清念珠菌抗体检测可早期快速诊断IC、区分念珠菌的定植与感染、与其他真菌无交叉反应、联合检测可以提高阳性率。
四、mNGS- 2020年欧洲指南确定了PCR检测和DNA测序在IFD确诊中的价值。①曲霉：无菌部位微生物学分析/培养、血培养、组织核酸诊断（福尔马林固定、石蜡包埋的组织中发现霉菌时，PCR扩增真菌DNA，并结合DNA测序）。②念珠菌：无菌部位微生物学分析/培养、血培养、脑脊液血清学分析（适用于隐球菌脑膜炎）、组织核酸诊断（福尔马林固定、石蜡包埋的组织中发现酵母菌时，PCR扩增真菌DNA，并结合DNA测序）。
- 明确了PCR检测在IA临床诊断中的价值。曲霉PCR检测（以下任意一项）：① 血浆、血清或全血连续 2 次或以上PCR检测阳性；② BALF重复2次或以上PCR检测阳性；③ 血浆、血清或全血至少1次PCR检测阳性，同时BALF至少1次PCR检测阳性。
- 2019 美国胸科学会（ATS）在真菌诊治指南也提出了PCR在IA中的诊断建议：对于严重免疫功能低下，例如血液恶性肿瘤、接受造血干细胞移植、实体器官移植的患者，疑似存在IPA时，建议应用BALF、血液或血清曲霉PCR检测作为评估的一部分（强推荐，高级质量证据）。
- mNGS检测真菌的优与劣：（1）优势：不需要培养，节省时间；相较传统方法（G/GM试验）可以精确区分物种，甚至亚型；在某些类型真菌的检测敏感性高于传统方法，比如曲霉；无需假设，可覆盖罕见真菌和其他类型病原体；通过核酸序列进行物种鉴定，特异性高；可检测真菌的耐药基因。（2）劣势：对采样要求较高，需要有效采集真菌感染的病灶部位；真菌细胞壁厚（如曲霉），或有坚固荚膜（如隐球菌），破壁困难，核酸不易释放，可造成假阴性；湿实验流程（比如建库）容易引入环境真菌或试剂中真菌核酸（如灰绿曲霉），的污染，造成假阳性；真菌基因组数据库不全，很多真菌缺乏全基因组数据（识别不出），且在公开的数据库中真菌序列经常存在人源序列的污染（识别错误）。
- mNGS检测真菌的注意事项：对于临床最常见的肺部真菌感染来说，最好的检测标本依然是BALF，尽可能贴近病灶部位取样，同时避免样本污染；优化破壁技术，提高核酸提取率；恰当合理的去人源技术，提高诊断的敏感性；对真菌的数据库进行验证、清洗和补充。
- mNGS检测的干扰因素：（1）假阳性的干扰因素：标本采集时、检测过程中的污染；背景微生物和开放部位定植菌的干扰；检测结果难以区分感染与定植病原菌；检出常规检测中少见病原菌的判断。（2）假阴性的干扰因素：标本中病原菌数量过少，人源背景细胞过多；病原体如分枝杆菌、真菌，细胞壁过厚，或躲避在巨噬细胞内难以破壁获得，核酸提取过程中的损耗；PCR扩增过程中的偏好；比对数据库的不全。
- mNGS检测结果解读（如何对检出的病原体分类）：分析检测出病原微生物的致病性：① 高等级的致病性真菌：如曲霉、肺孢子菌、马尔尼菲篮状菌、新生隐球菌，在大部分样本中都可能是病原体。② 中等级的条件致病菌：如念珠菌属，在外周血、脑脊液、穿刺液等无菌体液样本中可能是病原体，但在痰液、BALF、尿液中可能是共生菌，需结合临床特征慎重判断致病可能性。③ 低等级的条件致病菌：如念珠菌，在外周血、痰液、BALF、尿液等大部分样本中可能是共生菌，只在少数情况下如侵入操作后的脑脊液/外周血样本、感染性心内膜炎的赘生物中可能致病。④ 疑似背景微生物引起感染：在某些感染样本中能与低等级的条件致病菌相互转化。
- mNGS检测报告解读（如何结合临床判断结果）：（1）阳性结果判读：若mNGS结果阳性，且符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据mNGS结果指导临床决策。若患者mNGS结果阳性且符合临床表现，但缺乏除mNGS结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证，并进一步完善传统实验室检查加以验证。若患者mNGS结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据mNGS结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。（2）阴性结果判读：真阴性，排除感染；假阴性，根据其他辅助检查结果（如培养结果等）高度提示感染可能，建议再次重复mNGS检测。
- 分子生物学已经在临床实践中广泛应用，其中PCR在曲霉和念珠菌感染病理标本中具有确诊价值；2、mNGS刚刚在临床普及，正在积累经验，可以作为辅助诊断的指标，但尚不能作为病原学的确诊依据；3、mNGS给临床提供了一种高敏感性、特异性的病原微生物检测方法；4、正确应用：mNGS不应用于普通感染，而是疑难、危重、特殊感染患者，目前尚不提倡用于疗效随访和耐药性检测；5、重点关注：mNGS报告的正确解读：小心谨慎，结合临床，综合评估。
- mNGS在临床真菌感染诊断中的价值：（1）分子生物学（PCR,mNGS）已经在临床实践中广泛应用，其中PCR在曲霉和念珠菌感染病理标本中具有确诊价值；（2）mNGS刚刚在临床普及，正在积累经验，可以作为辅助诊断的指标，但尚不能作为病原学的确诊依据；（3）mNGS给临床提供了一种高敏感性、特异性的病原微生物检测方法；（4）正确应用：mNGS不应用于普通感染，而是疑难、危重、特殊感染患者，目前尚不提倡用于疗效随访和耐药性检测；（5）重点关注：mNGS报告的正确解读应做到小心谨慎，结合临床，综合评估。
综上所述，每个「G」都有自己最适合的检测地位：① BALF-GM，追捕IPA舍我其谁焉？② 血清G实验，最爱念珠菌血症；③ 血清曲霉IgG抗体，CPA的首选；④ mNGS，疑难、危重、特殊感染我当家。无论谁的「地盘」，都需要结合临床评估才有意义。
图文：王小虾
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发表于 2022-8-31 22:14:20
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发表于 2022-9-1 07:48:47
