彭静：武汉前线新冠病毒核酸检测实践分享

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直播精华丨彭静：武汉前线新冠病毒核酸检测实践分享

原创 彭静 SIFIC感染官微

当新冠病毒疫情来临，各国统考，世界真正成为了命运共同体，中国的经验，需要与全世界共享；世界的问题，中国也要思考解决方案。SIFIC计划在疫情期间，发挥所长，建立一个国内、国际专家交换抗疫经验的平台 - 全球抗疫，我们在行动，SIFIC在行动！
SIFIC计划在每周三、周六，组织在线学术交流活动，邀请国内、国际专家在线分享、交流与互动，形式多样，紧扣抗疫热点问题。
抗击冠状疫情，全球统考，世界各国的防控策略，各有千秋。但有一个共同迫切的需求，也是一切防控策略的基础，那就是病毒的检测。
如何提升病毒检测的质和量，是新冠疾病的早发现、早诊断、早隔离和早治疗的决定性因素，也决定了疫情的防控策略。各国都在争相研发更快、更准的COVID-19病毒检测方法。
包括中国在内，很多国家迄今为止的实践证明，检测对于平缓那条疫情增长曲线，至关重要。一个国家接受检测的人越多，全局就越清晰，就越可以采取有效的措施，控制疫情的传播。
这次，我们特邀来自武汉、上海和美国，工作在病毒检测第一线的专家，分享他们的实战经验。
讲者：彭静（华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科）整理：雷晓婷（江苏省中医院）审核：吴怀英（聊城市第三人民医院）/秦海燕（昆明市第一人民医院）来源：SIFIC全球抗疫 我们在行动
2020年1月，突如其来的新冠病毒疫情让武汉医务人员措手不及。在缺乏充足证据和相应指南，没有专家共识，且各种物资非常欠缺的情况下，早期武汉一线检验人员如何完成新冠病毒检测及临床标本检验任务，同时保护工作人员、落实生物安全？个中经历，既有酸甜苦辣，又有实战总结。华中科技大学同济医院检验科彭静教授从五个方面为您分享武汉一线的新冠病毒核酸检测经验。
一、从传播途径着手生物安全的主要措施新冠病毒主要经呼吸道飞沫和密切接触传播，可在患者呼吸道样本、血液、粪便和尿标本中检测到。相对封闭环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下，存在气溶胶传播可能。同时，粪便和尿液可对环境造成气溶胶或接触传播。检验人员直接接触临床标本、样本量多，工作中不可避免产生气溶胶，且早期患者临床标本中病毒载量高，生物安全是最要的。考虑到新冠病毒传播途径和检验科人员暴露的高风险，主要从以下几方面着手提高生物安全防控。
（一）必要的实验室生物安全设施，并对使用人员进行培训：1. BSL-2级生物安全柜：既保护操作人员，又保护样本；2. 配备高压灭菌装置；3. 废液处理系统；
（二）个人防护根据呼吸道传播病原体的特点，评估检验科不同岗位工作人员，如窗口人员，核酸检测人员，保洁员，消毒员的不同风险水平，采取不同的防护等级，并进行人员培训。在早期防护物资不足情况下，尤其强调医用防护口罩、手套的使用和手卫生（含乙醇手消毒）是最关键的防护措施。我科分子诊断组有6个人自始至终仅使用此三种防护措施，均没有发生院内感染。
（三）病毒灭活处理如不对病毒进行灭活处理，检验科人员极有可能发生感染事件，故病毒灭活很关键。经过不断摸索不同温度、时间条件，以及不同介质如干浴、水浴后，发现只有在56℃30分钟时干浴，不影响核酸检测。1月30日同济医院检验科发布《同济医院检验科新型冠状病毒流行地区临床实验室常见问题解答（第一版）》。除了热灭活，还有其它实验室病毒处理方法还包括：紫外线照射、75%乙醇、含氯消毒剂、乙醚、过氧乙酸、氯仿等病毒灭活手段，但实验室常规获得使用的是紫外线照射、75%乙醇、含氯消毒剂等等。另外，同济医院检验科对92份样本（其中7例弱阳性）采用了不同灭活方式，观察对新冠病毒核酸检测结果的影响：
从Ct值情况看：92份样本（7例弱阳性）：相对于未灭活组，56℃30min干浴条件下，以及盐酸胍条件下，Ct值变化不大。但延长干浴时间时，或水浴时，Ct值有升高趋势。提示不同的病毒灭活方法可能对弱阳性结果造成影响。

从检出情况看：A组：未灭活；B组：56℃ 30min干浴；C组：56℃ 60min干浴；D组：56℃ 30min水浴；E组：65℃ 30min干浴；F组：盐酸胍处理。
92份样本（7例弱阳性，见图）中，A组Ct值范围在33-39，基本呈弱阳性。B组和E组的前6个样本均为阳性，最后一个13号样本Ct值有区别，但不影响阳性结果。而C组、D组和F组的灭活方法对13号样本，就可能呈现阴性结果。故不同的病毒灭活方法得出的结果需要合理解释。 （四）实验室布局

检验科涉及到生化、临检、免疫、分子生物等各个专业和区域，涉及不同的检验标本。合理布局工作路线，才能保证各区域不发生交叉感染。

进入工作区域的路线：

样本进入实验室前首先在前处理区进行分拣或灭活，进入污染区时危险性已降低。避免了医务人员将活病毒带入其它区域。生物安全要点：口罩、手卫生（随手可及的以酒精成分为主的手消毒剂）、BSL-2生物安全柜、环境通风。特别强调：通风很重要。
二、试剂选择及结果报告

早期（未通过国家药品监督管理局批准前）试剂盒灵敏度差异显著。A医院检测阴性，在B医院可能出现阳性。一个单位用不同试剂，前后的结果也会不同，如何解释呢？

用不同的试剂盒，可能产生不同的检测结果。取84名怀疑新冠感染患者的咽拭子，使用三种试剂中任一进行检测，发现灵敏度差别很大。因此，任何试剂盒在用于临床检验前均需经过严格评估。

Ct值大于阳性判读值得需要复查吗
对于结果的解读及复查标准和方法面临的一些疑问第一个问题：大于阳性判断值的是否需要复查？第二个问题：复查仍然有扩增曲线的时候，怎么处理？第三个问题：单曲线，没有ct值，但复查以后仍然有扩增曲线，怎么处理？第四个问题：对于弱阳性ct值37-45的范围内的结果是真阳性还是假阴性呢？临床意义如何？如何解决这些问题呢？
彭教授做了详细的解答：首先是分析了在严格执行ct值<40的复查标准下不同结果的解读。接下来又对CT值>40的不同复查结果进行解读和分析。
最后彭教授也提出了几个建议：1、在目前整体人群阳性率不高，病毒载量慢慢下降的情况下，就对试剂盒检测灵敏度提出了更高的要求，因此建议选择质量好的试剂盒。2、设立合适的复查范围。3、建议是否报告“可疑”。4、建议用测序或者数字PCR作为判断补充。
三、痰液的液化新冠病毒感染者可能并存其它病原体感染，对不同标本而言，检出阳性率不同，代表的临床意义不同。大多已上市的试剂盒没有明确如何液化痰液。中国指南建议使用二硫苏糖醇 或蛋白酶K液化，美国CDC建议使用二硫苏糖醇进行液化，效果如何呢？我们比较了几种试剂的液化效果，其中蛋白酶K和二硫苏糖醇的液化效果相对比较好。虽然有研究显示痰液较咽拭子有较高的检出率，但实际工作中，新冠患者痰液样本的检测量较少，一方面因为只有约30%的患者有痰液，另一方面是没有有效的办法避免标本处理过程中对提取仪及环境的污染，因此有效的痰液液化可以降低污染的风险。
四、防止核酸污染的措施对于低流行地区，PCR检测人员经过严格培训上岗后，核酸污染的风险相对较小，但在疫区如超负荷工作时，就可能会遇到核酸污染的问题，如何避免呢？我们采取了以下几个措施：

正确佩戴手套：手套未紧密贴合拇指、食指和中指，在进行开盖操作时容易发生交叉污染。

正确使用生物安全柜：简单、整洁、避免通风口堵塞；操作前后紫外线照射，消毒剂随手可及；废液缸里有1/3体积的含氯消毒液，并且及时清理废液缸，保证废物不超过废液缸体积的2/3。

核酸提取仪去污染：每天多批次检测时，在每一批次检测完以后必须用75%的乙醇和核酸去除剂对仪器进行去污染。

重视通风：不定期对房间进行通风，每次至少持续30 min。

PCR扩增区去污染：PCR反应管必须盖紧，避免扩增后的核酸对环境的污染。

实验室随手可及的消毒剂。

五、核酸检测存在的问题的可能解决方案1、基于发病的不同阶段的需要重复采样送检。2、鉴于不同部位阳性检出率不同，需采集不同部位的标本。3、联合应用多种检测平台和方法：抗原检测、核酸检测（包括实时荧光定量PCR、数字PCR、测序等）以及抗体联合检测等4、后勤保障与合理的工作流程：是保证检测质量和生物安全的基础。合理规划检测操作流程细节，减少暴露时间和风险。
互动环节问：出实验室前防护服要喷含氯消毒剂吗？
彭静教授：实验室中，医用防护口罩、手套、手卫生是生物安全的最重要保障。防护服为一次性用品，不可反复使用。脱防护服时不需在防护服上喷洒含氯消毒剂，但必须做好手卫生，严格按照流程进行防护用品的穿脱。小结措手不及的疫情给武汉一线的检验人员提出了很大的挑战，他们在没有可借鉴的指南、共识、早期各种物资缺乏的情况下，克服各种困难、不断摸索，制定了流程、培训检验科各级各类人员，保证了生物安全，做到了“零感染”。他们丰富、宝贵的经验值得我们更多同仁学习。

小白天使

从传播途径着手生物安全的主要措施新冠病毒主要经呼吸道飞沫和密切接触传播，可在患者呼吸道样本、血液、粪便和尿标本中检测到。相对封闭环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下，存在气溶胶传播可能。同时，粪便和尿液可对环境造成气溶胶或接触传播。检验人员直接接触临床标本、样本量多，工作中不可避免产生气溶胶，且早期患者临床标本中病毒载量高，生物安全是最重要的
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jcyyhlb

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感谢老师的分享  好帖子

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小白天使

没有硬性规定负压的问题

四院张

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小小彬

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