快速诊断感染和检测耐药性的新技术

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快速诊断感染和检测耐药性的新技术
2019-6-2| 编辑: 小桔灯网|: 唯菌论

摘要: 撰写：周旸 丨 审校：吴红龙序言抗菌素耐药性已成为公共健康的巨大威胁。如果不加以控制，2050年死于抗菌素耐药性的人数将达到1000万。准确、合理使用抗生素依赖于快速的病原诊断和耐药性检测。本文探讨了近几年涌现 ...
撰写：周旸  丨 审校：吴红龙

序言

抗菌素耐药性已成为公共健康的巨大威胁。如果不加以控制，2050年死于抗菌素耐药性的人数将达到1000万。准确、合理使用抗生素依赖于快速的病原诊断和耐药性检测。本文探讨了近几年涌现的一系列感染快速诊断和耐药性检测的新技术，比较了其敏感度、精确度、适用范围、运用前景和各自的局限性，并着重阐述了DNA测序在病原、耐药性检测上的进展，有助于根据临床需求选择合适的检测平台和技术。



基于PCR的病原及耐药性检测



01
FebriDx



FebriDx可检测血液中C-反应蛋白（CRP）、黏病毒抗性蛋白A，区分细菌感染与病毒感染。该方法的优点在于时间短；但是无法检测特定的病原体。



02

ID Now 和 cobas Liat



ID Now 和 cobas Liat 可以特异性检测病原体，如流感病毒A&B，但该方法无法检测病原体的药物敏感性。



03

Unyvero



德国Curetis公司的Unyvero 和法国梅里埃公司的BioFire FilmArray系统均为多重PCR检测平台，根据感染类型的不同设计有特定的检测卡，样品处理方法快速、便捷。



Unyvero肺炎检测卡的病原检出的敏感度较低，仅为67%-73%；但是病原精确度可以达到94.9%–97.9%；可检测的病原数量有限，不包括在检测范围内的病原菌拉低了检出敏感度；革兰氏阳性菌的检出率仅为46.2%；10%的仪器不工作情况。Unyvero血液检测卡的病原检出的敏感度可达到96.8%，精确度可以达到99.8%；可通过检测mecA基因，在5小时内检测出脓毒症患者样品中的MRSA。该技术的广泛运用有赖于提高检测敏感度，增加可检测目标以及降低仪器原因的失败率。



04

BIoFire FilmArray



梅里埃公司的BioFire FilmArray系统可以同时检测细菌、病毒、真菌和寄生虫，并且可以检测耐药基因。该系统可在1小时内检测到14中常见的脑膜炎/脑炎病原体，其结果与其他病原检测的匹配度达到90.4%-99.8%。利用该系统进行病原检测，可显著缩短抗生素用药时间和住院时间。目前仅肺炎和血液感染检测模块可以同时检测病原体与特定耐药基因，其他模块无法检测耐药基因。



抗菌素敏感性快速监测



01
Accelerate Pheno



Accelerate Pheno™ 是全自动检测系统，可利用血培养样本进行微生物计数、致病菌诊断和药物敏感性检测。根据感染样本类型，使用荧光原位杂交来结合该样本中最常见的病原体细胞，检测被标记细胞在不同浓度抗生素中的生长情况，从而测定病原体的MIC及药物敏感程度。该方法的病原检测敏感性为94.7%-97.5%，准确度为98.9%-99.5%，药物敏感性与常规检测结果的一致性为94.1%-96.4%。该方法的病原检测时间为1.4小时，耐药性检测时间为6.6小时。但是依然需要进行血培养，延长了检测时间；所能检测的病原体较少，仅为16种。



02

微流控阵列检测法



斯坦福大学近期开发了一种诊断尿路感染的微流控阵列检测法，利用16S rDNA探针检测结合尿液样本中的细胞裂解产生的rRNA。在尿液样品中加入不同浓度的抗生素，利用上述方法即可快速检测病原体的药物敏感性及MIC。在已有报道的107个尿液样本中，该系统的检测敏感度达到98.5%，准确度达到96.6%，5小时检测时间内，病原菌的环丙沙星MIC检测准确率达到97.6%。探索性实验结果显示，利用该方法检测49株临床非致病大肠杆菌的药物敏感性，结果与传统的平板扩散法耐药性监测结果100%吻合。



03

环介导恒温扩增



利用环介导恒温扩增方法特异性结合肠杆菌科23S rRNA基因，也可检测大肠杆菌的药物敏感性，与液体药敏试验结果的一致性达到96.3%。



但是，只有在样品中的目标微生物（致病菌）达到足够的浓度，上述方法才能准确检测耐药表型。



基于测序的病原及耐药性检测



01
全基因组测序

   





高通量测序技术的发展为快速病原诊断、耐药性监测提供了新机遇。全基因组测序技术广泛用于病原溯源和特定菌株的抗菌素耐药性监测。全基因组测序适用于分析结核分枝杆菌耐药性，在1-3天内得到药物敏感性、耐受性信息，精确度达到93.6%-99.0%，敏感度达到91.3%-97.5%。全基因组测序依赖于菌株培养，因此不适合快速病原检测。



利用高通量测序进行病原检测，理想的情况下应在8小时内完成从样品处理到结果分析，以便在下一次抗生素用药前制定准确的治疗方案。但目前建库时间流程延长了分析所需的时间。几种测序平台相比，Illumina测序仪所需时间最长，Ion Torrent和Pacific BioScience的测序时间相对较短。Oxford Nanopore Technologies 的测序仪可以实时提供数据，结果输出时间比较灵活。从样品处理到得到报告，Ion Torrent测序平台的理论时间少于一天；在宏基因组病毒检测时，Oxford Nanopore Technologies 公司的MinION 在6小时内即可给出结果，而Illumina的MiSeq平台需要超过20小时。宏基因组病原检测的目标序列可以是特定序列（扩增子测序），也可以是鸟枪法随机测序。



02

扩增子测序





16S rRNA扩增子测序所用时间较长，因此不常用于病原检测。近期Oxford Nanopore Technologies 公司推出的全长16S rRNA基因Nanopore测序技术，可以在几个小时内检测到临床样品中的病原体。



16S/18S rRNA或者ITS扩增子测序可以检测细菌或真菌，但是在种水平上的精确度并不高。而且由于病毒缺乏类似的保守基因，扩增子测序难以用于病毒诊断。扩增子测序数据也无法提供菌株耐药信息。因此，也有针对菌株特异性序列、特定耐药基因序列进行的扩增子测序，有望显著提高检测的敏感度；但是目前这一方法所需的测序时间过长，不适合临床应用。



利用RNA诱饵序列来直接扩增样品中的目标病原体序列，是另一种精确检测病原体的方法，在结核分枝杆菌及其耐药性检测上具有不错的结果。但目前所需时间长，价格昂贵。



03

临床宏基因组测序





临床宏基因组病原检测不依赖于病原体培养，但是要精确、敏感地检测到病原体及耐药基因，需要排除人源序列的干扰。宏基因组测序已被应用于骨/关节感染、呼吸及相关肺炎、脑炎诊断领域，然而解读宏基因组测序得到的病原体数据时，需要考虑微生物污染以及病原体定植的情况。



Illumina平台具有测序时间长、读长短的缺陷，而Pacific Biosciences 和Oxford Nanopore Technologies开发的单分子测序方法可以克服上述缺陷。长读长有不仅有助于基因组装，还可以将耐药基因定位到宿主基因组上。Nanopore测序的价格经济，数据导出时间快，已被广泛用于检测尿液、粪便、血液和呼吸道样本中的病原体，可以检测到金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药性、大肠杆菌的β-内酰胺耐药性，以及埃博拉病毒、基孔肯亚病毒和丙型肝炎病毒。



宏基因组测序数据并不能直接预测耐药性，基因表达、耐药基因的宿主菌类型都会影响预测结果。利用株系特异性的耐药基因数据库，如肺炎链球菌耐药基因库，或可有助于预测该株系的耐药表型，但是该方法缺乏通用性。



结语



临床宏基因组测序可以在第二次使用广谱抗生素前，利用一次测试同时检测细菌、真菌、病毒、寄生虫和抗菌素耐药性基因，从而实现有针对性的治疗，减少不必要和不适当的抗菌素使用。虽然从基因型预测表型仍然存在挑战性，但避免全球耐药性危机的需求迫在眉睫，必须用快速而全面的诊断方法来取代传统培养方法。

tianzenglan

路过学习了，谢谢老师的分享

lyluoxiuhua

一系列感染快速诊断和耐药性检测的新技术，比较了其敏感度、精确度、适用范围、运用前景和各自的局限性，并着重阐述了DNA测序在病原、耐药性检测上的进展，有助于根据临床需求选择合适的检测平台和技术。学习了！

ynosmile

新的方法，路过关注，谢谢分享给大家！                          

小白天使

非常感谢老师的分享！！！