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作者：倪晓平
专栏编辑：丁韧
在医疗机构中，几乎所有的医疗活动都离不开水。预防与控制水源性病原微生物的传播，是医院感染管理的重要任务之一。从10月9日至今，围绕医疗用水的污染环节、医疗机构水源性感染暴发、以及医疗机构用水微生物检测策略与技术等等与水分不开的话题，倪教授为大家带来了9期精彩讲座：
- 晓平说消毒丨医疗机构用水微生物检测策略与技术（四）
- 晓平说消毒丨医疗机构用水微生物检测策略与技术（三）
- 晓平说消毒丨医疗机构用水微生物检测策略与技术（二）
- 晓平说消毒丨医疗机构用水微生物检测策略与技术（一）
- 晓平说消毒丨医疗机构水源性感染暴发特点（上）
- 晓平说消毒丨医疗机构水源性感染暴发特点（中）
- 晓平说消毒丨医疗机构水源性感染暴发特点（下）
- 晓平说消毒丨医疗用水的污染，一个聊不全也聊不完的话题（下）
- 晓平说消毒丨医疗用水的污染，一个聊不全也聊不完的话题（上）
在上一期的专题讲座中提及“欧美国家已采用R2A技术替代PCA，有研究表明同样的水样在R2A培养基上生长的细菌种类、数量明显多于或高于PCA培养基，那么您想知道R2A培养基的研发过程吗？请看本期讲座“R2A培养基的研发。请继续聆听医疗用水系列讲座之“现有水源性微生物检测技术的挑战”
R2A培养基的研发
直到上个世纪70年代，美国环保署要求对城市的用水或废水处理的质量监测采用平板计数琼脂法（plate count agar，PCA），接种方法为倾注法。该方法被视为标准平板计数法（SPC）。这一培养条件是基于“机体温度”37℃温度来设计异养菌的培养温度。
1.R2A研发前提
然而，这一沿用了数十年的检测技术，受到来自美国环保署市政环境研究实验室微生物学者Reasoner博士的质疑，并认为PCA技术是用于考核水质处理有效性的方法，而不是评价水质微生物安全性，或可饮用性的最适合方法；PCA只是检测适应于在富营养型、35℃培养温度下生长的异养菌，并不适于水体中所有需氧和兼性厌氧的异养菌。PCA培养条件可能只适合水源中一小部分细菌的生长，而大部分的细菌无法在人为设定的培养条件下生长，因为经过城市供水系统处理的水源，其水体中的细菌生长可能是很缓慢的，无法在48h设定的培养时间内形成菌落。
2.R2A的命名
Reasoner博士研究小组经过多年探索，在改良的Henrici培养基的基础上，设计了一款含有多种碳源成分，但浓度较低的新型培养基。为此，Reasoner博士以自己名字的第一个字母“R”，因为这是在Henrici培养基上设计的，不是原创产品，属于2次创造，再加上“agar”的第一个字母“A”，将其命名为：R2A培养基（见表2）。
3.R2A的优势
大量的实验证实，R2A是一款出非常出色的异养菌平板计数培养基，其异养菌的检出这类与数量明显优于PCA。但是深入研究发现，R2A却不适用于传代培养，为此，Reasoner博士的研究小组又在R2A培养基的基础上，将除丙酮酸钠以外的其他所有成分加倍，便设计出用于异养菌传代培养的培养基，取名为：R3A培养基（见表2）。
表2. 聽聽R2A和R3A培养基成分表
成聽聽聽聽聽聽聽分
| 剂聽量
| （g/L）
|
| R2A
| 聽聽聽聽R3A
| 酵母浸膏（Yeast extract）
| 0.5
| 1.0
| 蛋白胨（Difco proteose peptone no.3）
| 0.5
| 1.0
| 酪蛋白水解物聽（Casamino acids）
| 0.5
| 1.0
| 葡萄糖（Glucose）
| 0.5
| 1.0
| 可溶性淀粉（Soluble starch）
| 0.5
| 1.0
| 丙酮酸钠（Sodium pyruvate）
| 0.3
| 0.5
| 磷酸氢二钾（K2HPO4）
| 0.3
| 0.6
| 硫酸镁（MgSO4·7H2O）
| 0.05
| 0.1
| 琼脂（Agar）
| 15.0
| 15.0
|
最终的pH为7.2
从上表所列的培养基成分可以发现，其配方组成较PCA培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂10g～20g，蒸馏水1.0L，pH 7.4～7.6.）所含的营养成分明显降低，但碳源成分更广泛，作为贫营养型培养基，更适合水体贫营养环境中的异养菌的生长。
4.R2A的敏感性
为了进一步证实R2A培养基的敏感性，Reasoner等采用PCA培养基，分别以倾注法（pour plate）和涂布法（PCA-s）接种方式；R2A涂布法（R2A-s）和R3A涂布法（R3A-s）；薄膜过滤为基础的SPC（m-SPC），以及薄膜过滤为基础的R2A（R2A-mf）和R3A（R3A-mf）等7种方法进行比较（见表3），结果显示，涂布法接种，结合使用R2A培养基，获得较大数量的异养菌。
表3 聽不同检测方法的比较结果
7种培养基均设置35℃培养条件
1985年，美国环境保护署发布的《水和废水检测的标准方法》（第16版），推荐采用R2A培养基用于水中异养菌总数计数，接种方法包括倾注法、涂布法和薄膜过滤法，在20℃或28℃条件下，培养5d～7d；35℃条件下，培养时间不少于72h。
下期预告：R2A培养基的应用……
主要参考文献
1.Reasoner DJ, Geldreich EE, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49: 1-7.
2.Byrd JJ, Xu HS, Colwell RR, Viable but nonculturable bacteria in drinking water[J].Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57: 875-8.
3. 白晓慧，吴汉靓，王海亮，等. 饮用水中异养菌平板计数检测方法的比较[J].净水技术，2004,26（5）：65-67.
4. 顾孔珍，线纯，罗岳平，用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率[J].净水技术，2004,23（1）：42-44.
5. Williams MM,Armbruster CR,Arduino MJ, Plumbing of hospital premises is a reservoir for opportunistically pathogenic microorganisms: a review[J].Biofouling, 2013, 29: 147-62.
6. 李文明，李伟英，陆辉，等. 供水管网水样R2A培养基细菌总数测定及其影响因素探究[J].净水技术，2014,33（6）：66-70.
7. 李珏，洪利娅，王知坚，等. 制药用水微生物限度检查新方法的研究[J].药物分析杂志，2014,34（2）：376-379.
8. Capelletti RV, Moraes M, Waterborne microorganisms and biofilms related to hospital infections: strategies for prevention and control in healthcare facilities[J].J Water Health, 2016, 14: 52-67.
9. Safiri S, Ayubi E, Pseudomonas aeruginosa Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit Attributed to Hospital Tap Water: Methodological and Statistical Issues to Avoid Misinterpretation[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38: 1126-1127.
10. Bédard E, Laferrière C, Déziel E et al. Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buildings[J].PLoS ONE, 2018, 13: e0199429.
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发表于 2018-12-27 11:04
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