检索：张冰
译者：秦维霞
审校：周艳芝 李雷雷
编者按
革兰阳性菌，如金黄色葡萄球菌和粪肠球菌具有耐药性，在全球范围内对人类健康构成威胁。这些细菌存在于干燥的环境中，如医院的床栏杆（通常由塑料丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)组成）。这一表面作为病原体的蓄积地，可通过手或医疗设备的接触污染而导致这些病原体的传播。革兰阳性菌能在塑料制品表面存活多久？且看如下研究：
革兰阳性菌在医疗保健相关的塑料上的长期代谢持久性研究
众所周知，医源性病原体持续存在于医疗环境物体表面，这些病原微生物可能是由于新鲜的接种、经过不适当的清洁、或由于在大气中的细胞沉降形成。培养是监测物表病原体是否存在的最主要方法，也可采用分子学方法、ATP定量和代谢试验。与医疗保健相关的机会性病原体金黄色葡萄球菌和粪肠球菌在干燥环境中持续存在，如医院床栏（通常由丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）制造而成），这些床栏物表可储存病原体，并通过接触污染手和医疗器械，促进病原体传播。本研究旨在确定细菌在丙烯腈丁二烯苯乙烯上的存活持久性动力学。
材料和方法
采用聚合酶链反应(PCR)技术对该塑料表面进行基因组DNA检测，证实该塑料上是否存在细菌的细胞，而不考虑其活力。用培养、ATP定量和代谢试验在不同时间点测定细菌活力，时间至1年以上。用塑料圆盘接种这些有机体，并允许在干燥的环境中停留长达一年或超过一年的时间。
接种的塑料表面：使用6毫米0.062英寸厚的ABS圆盘(阿纳海姆工业塑料供应公司，CA)，在70%乙醇中孵育15分钟，以减少污染有机体，并在接种前风干。光盘接种10μL经过清洗的粪肠球菌进行培养(写明ATCC 19434马纳萨斯,弗吉尼亚州)或将金黄色葡萄球菌(写明ATCC 25923)悬浮在109细胞/毫升脑心浸液肉汤里(BHI，马里兰州)。肉汤被用来模拟病人体液中可能存在的表面污染的蛋白质。干燥后，将塑料盘在无菌培养皿中室温孵育16小时、3周、7周或大约1年。
结果
PCR试验证实在整个研究期间塑料上存在细菌。然而，培养3周和7周后，金黄色葡萄球菌的可培养性降低，1年后两种菌均不能培养。在7周时，这两种生物的ATP水平都降低了，这与金黄色葡萄球菌的可培养相一致，但ATP的定量并不能预测粪肠球菌的可培养性。培养7周后，金黄色葡萄球菌还原电位降低，而粪肠球菌还原电位在肉汤中培养12h后达到新鲜接种水平。一年后，每种病原菌的代谢活性都很低，但均处于显著水平。
结论
金黄色葡萄球菌和屎肠球菌细胞可在塑料上存活1年以上。
PCR检测的金黄色葡萄球菌数在1年无变化(图1A)。然而，3周后金黄色葡萄球菌的可培养性降低了2.5 Log10 (P < .001)，7周后又降低了2 Log10 (P < .001)，1年后未被培养。这表明，尽管细菌仍然存在于表面，但根据培养的结果，它们是不可存活的。在16小时和3周时，粪肠球菌菌落形成单位计数略高于PCR扩增的基因组DNA定量(P < .01)。7周后，菌落形成单位计数轻微下降(P < 0.001)， 1年后(图1B)后，细胞无法培养。
图1.培养16小时、3周、7周或>1年(金黄色葡萄球菌，751天；粪肠球菌，391天)，室温下在丙烯腈丁二烯苯乙烯塑料上培养和存在基因组DNA。而聚合酶链反应检测基因组DNA在1年以上仍保持稳定，可培养性明显降低，且具有生物特异性。(A)金黄色葡萄球菌。(B)粪肠球菌。n=3.平均值为均值±SD.**P<.01；***P<.001。
细胞ATP水平的测定通常用于医疗保健设施的质量控制，以检测物表残留的细菌污染。在本研究中，我们立即进行ATP检测，并在塑料上培育7周后进行平行培养和PCR检测。结果，7周后，金黄色葡萄球菌和粪肠球菌(图2)都只检测到低水平的ATP(图2)。该试验支持金黄色葡萄球菌培养数据，但与粪肠球菌培养结果相矛盾。
图2.室温下对丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)塑料进行16小时或7周时金黄色葡萄球菌和屎肠球菌ATP含量的测定。ATP储存减少7周，n=4。平均值为平均±SD。***P<.001。
维持还原环境的能力是细胞活力的一个指标。培养48小时、7周、1年左右接种于有普雷斯托蓝试剂的盘内进行培养。培养48小时后，金黄色葡萄球菌的代谢活动呈现典型的生长曲线，包括最小滞后期、指数期和逐渐减少的平稳期。培养7周后，金黄色葡萄球菌活力明显降低(P<0.001)。在>1年时间点，各生物体的代谢活性均显著降低。在培养6h(7~8小时，P<0.05)和9-16小时(P<0.01)时，金葡菌接种盘对瑞唑蓝的还原率明显高于对照组(P<0.01)。
经过48小时的培养，粪肠球菌的初始代谢活性基本一致，呈滞后、指数和平稳的生长曲线，并接近死亡阶段(图3B)。培养7周后，粪肠球菌还原力受1~11小时代谢活性变化的影响，但12h后细胞复苏并达到初始接种量水平。与金黄色葡萄球菌相似，接种粪肠球菌的盘在孵育8小时后，其还原率在背景上明显增加(8~16小时)(P<.05)。
图3.在室温下，用还原力法测定ABS塑料在48h、7周或1年(金黄色葡萄球菌392天、粪肠球菌356天)的代谢活性。(A)金黄色葡萄球菌。(B)粪肠球菌。n=3-5，其值为均值±SD值。48小时vs 7周，1~16小时(P<.0 0 1)，48小时vs 1年，1~16小时[P<0.0 1]。粪肠球菌48小时vs 7周，1~5小时[P<0.001]，6~11小时[P<0.01]。48小时与1年、1-17小时比较有显着性差异(P<.001).
讨论
这项研究比较了几种评估细菌在干燥环境中存活能力的方法，这些细菌是长期存在于被普遍用作床栏的一种ABS塑料。PCR证实，细菌基因组DNA在超过1年的时间内并没有明显减少，而培养能力则随着时间的推移而减少，ATP水平在7周后下降。最后，随着时间的推移，细胞的新陈代谢逐渐减弱，但并没有完全消除。这些不同的环境污染检测方法产生了不同的结果。
可培养性是检测医疗保健设施表面污染的主要方法。根据实验设计，金黄色葡萄球菌在干燥的无生命物体上存活长达12个月，而粪肠球菌则可存活长达46个月。在一个早期的研究中，在24小时后粪肠球菌菌落计数没有变化。在台面上，粪肠球菌可培养性已经记录了长达58天。8株粪肠球菌在室温下干燥保存16周后数量减少，可培养出4株。在玻璃上，5个金黄色葡萄球菌菌株存活至少6个月。在3周时，存活率受到最小影响，但倾向于减少7周。在12周内，在不锈钢上，粪肠球菌存活率明显高于金黄色葡萄球菌。当在各种地板材料上测试时，金黄色葡萄球菌的存活动力学变化很大。
在此描述研究中，虽然金黄色葡萄球菌细胞可以通过PCR-靶向基因组DNA检测到，但可培养性在3周和7周时会显著降低。相反，在这段时间内，粪肠球菌的可培养性受到的影响最小。正如其他人所观察到的，粪肠球菌比金黄色葡萄球菌的存活时间长得多。
ATP测量是一种在医疗保健环境中被接受的表面监测系统，使用3个独立的ATP光度测量系统检测不锈钢上的金黄色葡萄球菌ATP 10天。在这项研究中，ATP定量显示7周后两种生物体的水平显著降低。在金黄色葡萄球菌增殖细胞中观察到细胞内ATP的减少，并与另一种环境胁迫的存活相关：抗生素挑战。在这项研究中，ATP水平预测了金黄色葡萄球菌的活力和代谢，但对粪肠球菌菌株的预测较差。ATP存储水平可能不能准确地预测其存活能力。
在48小时、7周和1年的盘状细胞孵育后，16小时内的代谢活动被量化。金黄色葡萄球菌代谢活性在7周时显著下降，但一年后仍可检测到。7周时，粪肠球菌生长明显延迟，但细胞在良好的培养条件下12h后完全恢复。从理论上讲，粪肠球菌 ATP水平的降低可能是由于生长延迟所致，但一旦ATP储备得到补充，则最终实现了完全的存活能力。或者，恢复后，氧化还原酶的活性可能降低，生长恢复到正常水平。酶活性降低是休眠的指标之一，细胞可能需要1~1.5h才能恢复生长，与金黄色葡萄球菌一样，1年后底物明显减少。每个有机体在这个时间点的低活性水平可能表明细胞最终可能在一个有利的环境中恢复。
本研究表明，在ABS塑料上干燥的金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的基因组DNA含量在1年以上变化很小。培养7周后，金黄色葡萄球菌的存活率显著下降，而粪肠球菌的存活率没有明显下降。即使ATP水平显著降低，粪肠球菌细胞仍能保持可培养性和代谢活性。即使细胞不能培养，代谢活性也会保持下来，这意味着一种可存活但不可培养或持续的状态。
金黄色葡萄球菌和粪肠球菌能够休眠并进入这种状态，这是微生物对环境压力的反应，包括营养饥饿，从而使细胞得以存活。生物在新陈代谢复苏后重新恢复其毒性。干燥也可能是潜在的环境压力源。虽然休眠细胞不能被培养，但它们以较低的速率进行大分子合成和呼吸，合成信使RNA，并继续进行氨基酸摄取等功能。细菌的代谢活性与毒性有直接关系；许多毒性决定因素都受养分有效性的控制。在革兰阳性菌中，包括葡萄球菌和链球菌，控制二肽渗透酶Y蛋白家族的成员，以及其他调控因子在营养丰富的生长过程中通过直接和间接的机制对毒性表达进行转录负调控。当营养物质耗尽时，毒力基因就会表达。长时间在塑料上无疑包括营养限制，这表明这些生物准备对改善的环境条件作出毒性反应。
参考文献：
Loree C. Heller PhD, Chelsea M. Edelblute MS. Long-term metabolic persistence of gram-positive bacteria on health care-relevant plastic[J]. American Journal of Infection Control, 46 (2018) 50-3.
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发表于 2018-6-17 12:22
发表于 2018-6-17 21:16
