万古霉素抗药性肠球菌之筛检及实验室诊断----台湾感控

樵夫

万古霉素抗药性肠球菌之筛检及实验室诊断
王梨容1,2　刘清泉1,3　柯文谦1,4
国立成功大学医学院附设医院
1感染管制中心　2病理部　3小儿科部　4内科部

    万古霉素抗药性肠球菌(vancomycin-resistant enterococci)将是院内感染重要病原菌之一，常见菌种为Enterococcus faecalis及Enterococcus faecium，而这些菌株能在病人间快速传播造成院内感染，甚至群突发之发生；因此除临床检体检出外，亦须采取适当监测措施，包括VRE移生病人监测及环境监测，再依监测结果采取适当之防护政策。利用增殖性培养液、选择性培养基或PCR方法，提高临床检体或监测检体中肠球菌检出率，并依标准方法进行菌种鉴定，及体外药物敏感性试验，将VRE与其它具内源性vancomycin抗性之肠球菌加以正确区别，才能实际而有效执行VRE感染控制防护措施，避免人力、物力或成本上浪费。
前　言
    肠球菌(Enterococci)是重要的院内感染病原菌，约有17种次菌种，临床相关感染以Enterococcus faecalis及Enterococcus faecium为主；由于肠球菌对glycopeptide类抗生素，如vancomycin 与 teicoplanin 抗药性的浮现，使得微生物实验室在肠球菌抗药性菌株的筛检及菌种的鉴定上益形重要。
    在革兰氏阳性菌中，Lactobacilli、Pediococci、Leuconostocs菌属与肠球菌中之E. casseliflavus、E. gallinarum 均具内生性vancomycin抗药性，这些低程度vancomycin抗药性之菌属/株对glycopeptide 抗药基因之传递能力很低，很少会造成临床感染或后续传播。其中E. casseliflavus及E. gallinarum在住院病人与长期医疗照护机构住民，肠胃道之分离率分别为0.5-2% 与15%，通常这类菌株之移生病人并不需要加以隔离。但另一方面，E. faecalis及E. faecium对药物之治疗呈现不同反应，若获得外源性抗药性基因vanA及vanB，便会成为对glycopeptide呈抗药性之VRE，并在病人之间快速传播[1]。因此，临床微生物实验室必需针对肠球菌进行菌种鉴定及体外药物敏感性试验，以提供临床治疗之参考。以感染管制的角度而言，快速且正确的将VRE与其它具vancomycin内源性抗药性之菌株加以区别，才能执行有效的感染控制防护措施，防范群突发之发生。

樵夫

VRE之监测与环境采检
肠球菌为肠道之正常菌丛，因此粪便或直肠拭子均可做为VRE带原者筛检之检体。临床检体直接涂划于选择性培养基，于37℃培养。环境VRE筛检则以棉棒浸拭法(premoistened swab)采集检体，采检后将棉棒拭子置入非选择性增殖培养液(例如：brain heart infusion broth)中6-18小时后，次培养到选择性培养基中。VRE移生病人之筛检，则可用选择性培养基或选择性培养液来培养，亦可于培养基/液中加入6μg/mL vanco-mycin来提高检出率 [2]。一般针对VRE所用之选择性培养基可为：CAN blood agar plate with vancomycin、Campylobacter blood agar plate with vancomycin、Columbia CAN-Va 30 μg disc blood agar plate、Enterococcosel agar with vancomycin, 选择性培养液如： Enterococcosel broth with vancomycin；最后将选择性培养基上长出之vancomycin抗性菌株，再次接种于5% 血液培养基，并确认该菌株为革兰氏阳性球菌后再进行后续鉴定

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VRE之监测与环境采检
肠球菌为肠道之正常菌丛，因此粪便或直肠拭子均可做为VRE带原者筛检之检体。临床检体直接涂划于选择性培养基，于37℃培养。环境VRE筛检则以棉棒浸拭法(premoistened swab)采集检体，采检后将棉棒拭子置入非选择性增殖培养液(例如：brain heart infusion broth)中6-18小时后，次培养到选择性培养基中。VRE移生病人之筛检，则可用选择性培养基或选择性培养液来培养，亦可于培养基/液中加入6μg/mL vanco-mycin来提高检出率 [2]。一般针对VRE所用之选择性培养基可为：CAN blood agar plate with vancomycin、Campylobacter blood agar plate with vancomycin、Columbia CAN-Va 30 μg disc blood agar plate、Enterococcosel agar with vancomycin, 选择性培养液如： Enterococcosel broth with vancomycin；最后将选择性培养基上长出之vancomycin抗性菌株，再次接种于5% 血液培养基，并确认该菌株为革兰氏阳性球菌后再进行后续鉴定。
肠球菌之鉴定流程[/b]
临床微生物实验室在肠球菌之菌种鉴定，基本上利用其生化学上之反应来测试，包括：革兰氏染色、PYR生成测试 (pyrrolidonyl arylamidase production test)、产色试验(pigment production test)、运动性试验 (motility test)、xylose快速发酵试验 (xylose rapid fermentation test)、arabinose 及 pyruvate发酵试验，其流程见图一及图二[1]；再依表一 [3]之反应结果确认肠球菌菌种。
肠球菌的色素检测 (pigment production)需以棉棒沾取菌落并于白色背景下观察是否有黄色 (bright yellow)出现，不可直接由培养皿观察菌落颜色。Motility test则将菌株置于0.5mL之BHI (brain heart infusion) 或 TSB (Tryptic soy broth)中，30℃培养2小时观察。xylose快速发酵试验之菌株浓度需达~90失3 McFarland标准浓度，以避免伪阴性结果之产生 [1]。
商用套组之鉴定系统亦可用于肠球菌之鉴定，包括Vitek 2 automatic system(BioMerieux, Vitej, Hazelwood, MO)、MicroScan POS 6 panel (Dade MicroScan Inc., Sacremento, CA)、API 20S Streptococcus and Rapid Strep strips (BioMerieux)，但偶会有鉴定错误的情形 [1]。基因分型法，如conventional multiplex PCR (m-PCR) protocol, real-time PCR (LightCycler system, Roche)，乃直接侦测 VRE抗药性基因的类别，可相对提高vancomycin抗性肠球菌鉴定之速度、特异性、及时效性[4]。

VRE之药物敏感性试验
肠球菌属对vancomycin之体外药物敏感性试验，以30μg之纸锭进行测试，所用培养基为Mueller-Hinton agar，菌液浓度为0.5 McFarland标准浓度 (可用生长期方式或直接调菌方式调配菌液)，置于35℃±2度之恒温培养箱中达24小时后 (其余纸锭培养16-18小时即可)，以透视光 (transmitted light)观察判读；抑制圈大小之判读标准为：≦14 mm、S (susceptible, 敏感性)；15-16 mm、I(Intermediate,中程度抗性)；≧17
mm、R(resistant, 抗性)，抑制圈中有薄膜状或菌落出现其结果均判读为抗性[5]。判读为中程度抗性之菌株，须依CLSI/NCCLS文件 (M100-S15)之标准方法 [5]，再次进行vancomycin抗性试验及MIC测试。(表一)

Vancomycin抗药性筛检试验
将菌落接种于含6 μg/mL van-comycin之BHI agar上，18及24小时均判读一次，长出菌株若鉴定为非E. casseliflavus及E. gallinarum之肠球菌则判定为VRE (表二)[5]。若菌株筛检结果为"nonsusceptibile"，则必须保留菌株，并送至可依NCCLS/CLSI标准进行菌种及药物敏感性试验之参考实验室进行确认。
要确认VRE之glycopeptide抗药性，可采用broth dilution test, agar dilution test(表三)，或Etest (ABB-IODISK, Solna, Sweden)。需注意的是须培养24小时后，才可判读vancomycin之MIC值；判读标准为：≦4 μg/mL、S(susceptible)；8-16μg/mL、I(intermediate)；≧32 μg/mL、R(resistant)。

樵夫

讨　论
依美国疾病管制局标准作业准则[6]，必须对VRE病人采取适当的监测及防护政策；因此VRE监测培养结果之敏感性相对的会影响到管染管制政策执行之有效性。VRE(移生)病人之肠胃道是VRE院内传播之贮存窝，因此监测培养之检体来源可以为粪便检体或直肠拭子(rectalswab)；直肠拭子培养之敏感性虽比粪便培养来的低[7]，但基于采检时间点及便利性之考虑，一般仍以直肠拭子为主。研究报告[8]指出，直肠外围拭子(perirectal swab)在VRE肠道移生筛检之敏感性及特异性，与直肠拭子并无差异性，因
此对白血球低下病人或在病人采检舒适性的考虑上，也可以用直肠外围拭子送检。
环境筛检方面，由于VRE可在干燥的环境表面存活数天至数月[9]，因此VRE可能由具菌株传播能力之采检点，包括工作人员之衣服、器械、病人外围环境等分离出，例如：医护人员使用之携带式器械 (如：压脉带、止血带)、环境中之床栏、轮椅、血氧侦测器 (pulse oximeter)、门钮、床旁桌、布帘、电子耳温枪、治疗床等分离出[9]。以实际经验而言，monitor面版、病床遥控器、床栏、换药车台面、床上体重计之面布、床上磅秤垫子及按键、烤灯架、工作车、耳温枪、氧气筒架子之扶手及流量表旋钮等，都是环境VRE阳性采检点。因此在进行VRE环境筛检时，阳性个案之外围环境、邻近区环境及医护人员经常碰触之公用物，都是须考虑之采检点，以提供单位环境清洁消毒时之参考。
粪便检体约需具10 3 CFU/mL之VRE菌落浓度才能于直接涂划之培养基培养出[10]；但当带菌者之排出菌落数低时，则必须配合培养液(broth)之增菌作用来提高检出率[10]，否则GRE (glycopeptide-resistant
enterococci)的分离率会有低估之可能性。用于VRE筛检之培养基/液可以有多种选择，并可在选择性培养基/液中加入之vancomycin以增加VRE的筛检度，其添加浓度可由4到64μg/mL，虽然高浓度较易侦测出高程度的vancomycin抗性菌株同时可将E. casseliflavus及E. gallinarum排除，但因有的vanB-VRE菌株之MIC可低到4 μg/mL而可能因此被忽略，因此一般以加入6 μg/mL来将低程度glycopeptide抗性菌株侦测出。
病人肠胃道VRE移生筛检之培养通常约需48-72小时，甚至5天才能得知结果，报告发出时病人可能已经离院；利用PCR分析法可在8小时内侦测出vancomycin抗药性基因vanA及vanB[11]，研究结果显示在有VRE移生之病人，其后续以PCR分法侦测出阳性机率之敏感性比以直肠拭子培养高，报告时间也缩短[12]；而将直肠拭子接种入EV broth (enterococcosel enrichment broth with 8μg/mL vancomycin)， 再利用real-time multiplex PCR 分析法监测则可更提高VRE筛检之检出率[13]。
依美国疾病管制局标准作业准则，VRE隔离病人需在隔周连续三次检测筛检均为阴性时才可解除隔离。Karin等人依CDC准则针对116位VRE带菌者进行监测培养，连续五周监测培养结果之阴性比例分别为64%、92%、95%、100%、100%[14]，验证了CDC针对VRE病人解除接触性隔离之作业准则；Green等人研究中指出，粪便检体中之VRE浓度若>10 6 CFU/mL，可能与病人肠道VRE之持续性移生有关[15]，而VRE菌落密度低之粪便相对的在环境污染之效力也会降低[7]。但VRE病人追踪监测结果阴
性并不表示已将VRE由病人之肠胃道移除，只能代表菌落数降低到可侦测范围。一旦再度因抗生素使用抑制了正常菌株的竞争作用，此类病人仍会有VRE再次复发之可能。

樵夫

结　论
检体VRE筛检所使用之培养基/液对检测结果之敏感性、特异性、人力及时间之花费上均有所差异，由于低程度vancomycin抗药性之肠球菌E. casseliflavus、E.gallinarum亦可由肠球菌之选择性培养基/液中分离出，因此临床实验室应建立临床检体与监测检体之VRE筛检方法，快速且正确的鉴定出E. faecium或E. faecalis之VRE菌株，才能有助于VRE感染管制政策之确实执行