少见病原菌所致感染性疾病之病原学诊断

黑旋风

见病原菌所致感染性疾病之病原学诊断
作者：解放军总医院微生物科 沈定霞
来源：中国医学论坛报2013年11月28日A4-A5
由常见病原菌如葡萄球菌、肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等引起的感染性疾病容易得到病原学诊断，但对一些少见病原菌所致的原发性感染，如果没有正确的病原学鉴定，则很难进行早期、正确的临床诊断以及相应的抗感染治疗。以下介绍少见病原菌所致感染性疾病的病原学诊断的重要性。
类鼻疽伯克霍尔德菌引起全身感染伴肝脓肿
病例简介
患者男，48岁，海南省三亚市居民，反复发热1月余，右上腹疼痛伴黄疸1周。患者于1个月前无明显诱因出现发热（体温37.8℃左右），伴寒战、大汗，咳嗽，有少量白色稀痰，之后反复出现发热。1周前患者感觉右上腹隐痛，并逐渐出现皮肤及巩膜黄染。有2型糖尿病史。
入院查体，体温36.9℃，腹部柔软，右上腹轻压痛，无明显反跳痛，腹部无包块，肝、脾未触及。腹部CT提示肝脏多发感染病灶，诊断为肝脓肿。入院后患者间断性寒战高热，体温最高达39℃。先后采血培养5次，均提示有类鼻疽伯克霍尔德菌生长。使用亚胺培南1 g/8h，共18天；其间加用哌拉西林/他唑巴坦4.5 g，1次/8h 2周。出院前采血培养为阴性，腹部CT示肝叶病灶基本消失。
病原菌所致疾病特点
类鼻疽伯克霍尔德菌，又称类鼻疽假单胞菌，是类鼻疽的病原菌，最早分离于1912年，主要存在于热带及***带地区的土壤中，人类通过破损的皮肤接触带菌的土壤或水源引起感染，也可通过吸入或食入污染物而导致感染。感染后潜伏期长短不一，短则3～5天，长的可达20年以上。长期潜伏于机体的病原菌在机体抵抗力下降时发病，糖尿病患者易患病。
该病多数起病急，以急性肺部感染最为常见，急性脓毒症是最严重的类型，病死率高；也可表现为肾炎、心包炎、肺脓肿、肝脓肿、脾脓肿等。慢性发病者有的似肺结核，出现浸润性改变、空洞及肺门淋巴结肿大。故类鼻疽的临床表现具有多样性，易误诊。
我国类鼻疽伯克霍尔德菌感染病例主要来自海南、广东、广西等地。在非流行区，诊断颇为困难。随着我国旅游人群及“候鸟人群”（北方居民到海南过冬）的增加，南方染病北方发病已有发生，了解患者居住史，有助于临床诊断。
病原学诊断
由于类鼻疽伯克霍尔德菌感染后的临床症状多样，且缺乏特异性，病原学检查具有重要意义。
细菌特征：在血平板和中国蓝平板上均可生长，在MH平板上不形成色素。从孵育箱中取出平板时有杨桃味，48小时味道更明显。由于该菌容易通过气溶胶传播，应避免开盖嗅其味道。在血平板上经过35℃培养24小时可见光滑的小菌落，48小时可见溶血环，菌落不透明，粗糙，呈灰白色，中心厚实，凸起，边缘平坦，有不规则皱褶。触酶和氧化酶阳性，吲哚阴性，动力阳性，不发酵葡萄糖，能分解乳糖、麦芽糖、甘露醇，还原硝酸盐，且能在42℃生长（见图1、图2）。
显微镜下可见两端浓染的革兰阴性小杆菌，直或微弯曲，无芽孢。对青霉素和黏菌素及多黏菌素B耐药，99%菌株对阿莫西林/克拉维酸（20/10 mg）敏感（抑菌圈直径≥18 mm）。
抗菌药物选择
类鼻疽伯克霍尔德菌对氨苄西林、替卡西林、头孢唑啉、头孢西丁和庆大霉素的耐药率为100%，对复方磺胺甲公式唑的耐药率超过55%，对哌拉西林/他唑巴坦和头孢他啶的耐药率分别为15.8%和18%，目前没有发现对亚胺培南耐药的菌株。美国微生物学会推荐液体稀释法进行药敏试验，但提倡在生物安全3级（BSL-3级） 实验室开展。推荐的治疗方案为初始采用头孢他啶或亚胺培南或美罗培南10~14天，以后改为口服磺胺3~6月，若对磺胺过敏，可选用多西环素或阿莫西林/克拉维酸。
布鲁杆菌引起腰椎感染
病例简介
患者女性， 44岁，居住在内蒙古，因反复腰痛伴发热半年入院。患者于半年前无明显诱因出现腰部酸痛，无下肢麻木和疼痛，症状逐渐加重，出现腰部肿胀，以腰骶部为重，坐、立或行走时腰痛加重，平卧可缓解，伴发热，最高达39.5℃。患者有动物皮毛接触史，无烟酒嗜好。
腰椎磁共振（MRI）显示，腰2~5椎体及周边软组织内异常信号；腰2~3、3~4、4~5椎间盘轻度突出。查体：脊柱生理弯曲存在，腰肌无强直，腰椎活动受限，腰2~5棘间压痛，叩击痛阳性，双下肢感觉正常。
初步诊断为腰椎体病变，腰椎间盘突出症。
入院后在局麻下进行病灶穿刺，抽出淡红色血样液体和脓液约10 ml，病理检查提示肉芽组织及大片渗出、坏死，伴透明变性。入院后2次血培养结果为阴性。红细胞沉降率为54 mm/h，C反应蛋白（CRP）6.18 mg/L。结核抗体检测阴性。直到病灶穿刺液细菌培养报告布鲁杆菌生长，采血做布鲁杆菌凝集试验为阳性，布鲁菌病的诊断才明确。
病原菌所致疾病特点
布鲁菌病是由布鲁杆菌引起的人兽共患急、慢性感染性疾病，在我国已有聚集和散发病例报告。布鲁杆菌是专性细胞内病原菌，一旦进入机体，能逃脱吞噬细胞的杀灭，并释放入血，随血液至不同部位导致不同器官感染。通常能在单核内皮细胞系统中存活，在相应组织器官，如骨髓、肝、脾、淋巴结、肺中形成肉芽肿或脓肿。
布鲁菌病的临床表现形式多样，如波浪热、寒战、盗汗、头痛与体痛、乏力。也可表现为各脏器组织感染，如骨、关节、肝、脾、肺、眼、皮肤软组织或中枢神经系统及心脏受累。心内膜炎是布鲁菌病患者死亡的主要原因，约占5%。该病潜伏期通常是暴露后10～14天，也可短至5天或长至35天，呈急性或隐匿性。
病原学特点
病原学检查是诊断布鲁菌病的重要依据。取病变部位标本进行细菌培养。布鲁杆菌为严格需氧菌，最适温度37°C，血平板上形成圆形、突起、无色半透明、光滑湿润、边缘整齐、不溶血的小菌落（图3、图4）。涂片镜检为革兰阴性小球杆菌或小杆菌，无芽孢，排列如细沙样。氧化酶、触酶阳性，氧化葡萄糖、硝酸盐阳性，尿素强阳性（15分钟内快速阳性），分解蔗糖、枸橼酸盐阴性，不分解阿拉伯糖、半乳糖，不产生硫化氢，不分解精氨酸，无动力。
血清学试验可帮助快速诊断。单次血清抗体滴度＞160有意义。也可取急性期和恢复期双份患者血清（间隔2周以上）进行凝集，如抗体滴度呈4倍或更高倍数增加，可明确诊断。
抗菌药物选择
世界卫生组织推荐多西环素200 mg/d和利福平600~900 mg/d联用，疗程6周。亦有人认为多西环素200 mg/d加氨基糖苷类链霉素1g/d，肌注2周，效果亦佳。此外，喹诺酮类有很好的细胞内渗透作用，可选用。对布鲁杆菌脑膜炎患者可联用头孢曲松与利福平。
荚膜组织胞浆菌致肺部感染
病例简介
患者男性，67岁，地质大队高级工程师，入院前在墨西哥工作半年，曾到山高林茂、阴暗潮湿的蝙蝠洞内采集样品。2013年1月7日左右，患者身感不适，气短、乏力，继而头痛、发热、咳嗽，恶心呕吐，下肢肌肉持续痉挛。在墨西哥当地医院以感冒治疗，退热后于2013年1月25日回国。2月4日，患者到陕西省汉中市某医院就诊。
CT影像报告示：双肺血管束及支气管束增多、杂乱，边缘模糊。纵隔多发淋巴结肿大，双肺多发转移瘤。遂以双肺多发转移瘤和重症肺炎收入院。
入院查红细胞沉降率53.00 mm/h；C反应蛋白（CRP）63.00 mg/L；降钙素原（PCT）0.35 ng/ml。支气管镜检查提示镜下支气管树炎症。使用左氧氟沙星和美洛西林抗感染。
入院第3日，行CT引导下穿刺，穿刺肺组织送病理学和细菌学检查。病理报告：在左下肺刷片内见鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞及腺上皮鳞化现象，未见恶性肿瘤细胞。2月14日CT报告：双肺多发结节状、斑片状高密度影，对比2月4日片，结节改变不明显，小片状病灶稍增多，左侧少量胸腔积液。
细菌学检查，在72小时普通和厌氧培养均无细菌生长。10天时，在25℃培养的沙保弱培养基上可见微小、白色干燥菌落，菌落表面有微绒毛，涂片镜检见真菌菌丝，并有垂直出芽。将菌落点种至2块沙保弱平板，分别放置25℃和35℃孵箱。培养10天后，在25℃孵育的沙保弱培养基上生长出绒毛状白色菌落。35℃孵育的沙保弱培养基上始终未见真菌生长，但最初接种标本的血琼脂平板经过35℃孵育20天后长出酵母样菌落。对丝状菌落进行乳酸酚棉兰染色，见典型的大分生孢子，30%的大分生孢子表面有指状突起。
实验室遂以荚膜组织胞浆菌发出报告，后经基因测序结果证实该病原菌为荚膜组织胞浆菌荚膜变种。
临床根据病原学结果进行抗真菌治疗，采用伊曲康唑200 mg/d静滴2周后,改为40 ml/d口服100天。8月2日CT复查报告：原双肺内弥漫多发团片状、结节状及条索状高密度影较前减少。纵隔淋巴结明显减少。左侧少量胸腔积液基本吸收。
与该患者一同工作的另一例男性患者，具有相同症状和流行病学史，根据此病原学检测结果进行了抗真菌治疗，病情好转。
病原菌所致疾病特点
组织胞浆菌病是由组织胞浆菌引起的感染。通常吸入带菌的尘埃，可致一过性肺部感染，无明显症状，也可表现为轻度或中等程度的症状，如干咳、胸痛，儿童可发热。严重病例可有消瘦、无力、盗汗和咯血，颇似结核。胸片示肺部散在浸润、肺门淋巴结肿大，最后留下均匀分布的钙化点。在流行地区约10%的患者由于吸入大量孢子，可发生较严重的症状，如高热、气急、胸痛，类似急性肺炎。免疫力低下者，可有进行性、播散性或爆发性的表现。少数病例可以转为慢性或表现为皮肤黏膜溃疡或肉芽肿，出现于口腔、舌、咽喉、胃肠、外生殖器或皮肤。骨和关节很少被波及。确诊需要对该菌进行分离、培养和鉴定。
病原学特点
组织胞浆菌是双相性真菌，分为3个变种：荚膜变种、杜波变种和腊肠变种。荚膜组织胞浆菌主要存在于富含鸟粪和蝙蝠粪的土壤中，在北美、中美和南美较多见，也可见于我国南方地区。
该菌在沙保弱培养基上25℃培养生长缓慢，2～3周可见菌落生长，初为白色，逐渐变成淡棕色或粉色、呈棉花状或颗粒状或绒毛状菌落，背面为白色，有时见黄色或橙黄色。患者标本通常于脑心浸液或其他营养琼脂中37℃培养，菌落湿润、表面光滑、为乳白色的酵母样菌落。显微镜下，菌体常位于单核细胞或巨噬细胞内，芽生孢子卵圆形、有荚膜，单芽、芽颈较细。培养较长时间可见大分生孢子，壁厚，有管型或柱型的突起（图5、图6）。
抗真菌治疗
对组织胞浆菌感染重症患者应首选两性霉素B 0.4~0.5 mg/（kg.d）,1次/日，至少10周，也可先用两性霉素B，症状改善后改用伊曲康唑；非急性患者可首选伊曲康唑200~400 mg/d,疗程为6个月。（病例为陕西汉中3201医院辜依海提供）
嘴突脐孢霉致美国暴发罕见真菌性脑膜炎
案例简介
2012年9月起美国暴发全球轰动的真菌性脑膜炎，与注射受真菌污染的类固醇药物相关。该药最早生产于2012年5月1日，约1.8万瓶药销往美国23个州的76家医疗机构。美国疾病控制和预防中心（CDC）与美国食品和药品管理局（FDA）已确认，真菌性脑膜炎疫情主要由不具传染性的嘴突脐孢霉引起。实验室检测证实，其中3个批次的类固醇涉及这类真菌污染。截至2013年9月6日，美国CDC表示经实验室检测确诊真菌性感染者达750例，其中单纯性脑膜炎患者233例，脑膜炎合并脊髓感染者151例，死亡64例。疫情分布于美国20个州，其中最严重的是密歇根州、田纳西州和印第安纳州。
病原学特点
引起真菌性脑膜炎的常见病原菌有新型隐球菌，其他真菌如曲霉菌、念珠菌、接合菌、毛孢子菌、球孢子菌、芽生菌、组织胞浆菌、突脐孢霉等致病性和条件致病性真菌也可引起真菌性脑膜炎。
引发此次真菌性脑膜炎的嘴突脐孢霉是土壤和植物中常见的真菌，尤其多见于草类。其培养特征是生长快，菌落呈深灰色至黑褐色，表面为棉絮状或绒毛状，背面为黑色。
显微镜特征：菌丝分隔，颜色深暗，分生孢子梗长，在生成分生孢子处弯曲。分生孢子棕色，壁厚，长，镰刀形，通常有7～11个分隔。在分生孢子两端细胞的横隔颜色明显变深且具有脐（图7）。
疾病特点
真菌性脑膜炎由真菌侵入中枢神经系统后引起的脑膜炎症，常与脑实质感染同时存在，多由血流感染发展而来。真菌性脑膜炎发病缓慢，临床表现缺乏特异性，主要为低热、头痛、恶心呕吐、颈项强直、畏光、情绪淡漠、肌肉反射性痉挛等，与其他类型脑膜炎不易鉴别，如不及时救治可致患者死亡或永久性脑损伤。
诊断需结合病史、临床表现、影像学检查及实验室检测，实验室检查对最终病原菌的确诊十分关键。分子生物学检测（如DNA序列测定）是目前诊断少见真菌性感染的重要手段。当怀疑真菌性脑膜炎时，应反复送检涂片镜检及真菌培养，必要时，采用分子生物学检测方法。
真菌性脑膜炎不具有传染性。双重或多重感染患者多因体质较弱、营养较差和免疫功能下降，可伴发其他病原菌的新感染或体内既往潜在病原菌的复发感染，使病情更严重复杂和表现多样化，甚至成为死亡的重要原因。
抗真菌治疗可酌情选用或合并应用二性霉素B及其脂类制剂、伏立康唑、伊曲康唑等唑类制剂。（此案例为北京宣武医院曹敬荣提供）
（本文通过对上述4个病例的分析，希望能提示临床医生，对非特异症状的患者要想到感染性疾病，将感染部位标本送病原学（不仅是细菌）检查；同时希望提示临床检验科，微生物实验室要采取多种手段（包括培养基的种类、培养温度及培养时间），才能将少见和慢生长的病原菌检测出来。）

阡陌

常感谢鬼才老师分享，留着做课件用。

阡陌

不起是黑旋风版主，思想还停留在“流行病”那。

良龙马

习了鬼才老师分享的以下4个病例的分析：
1、类鼻疽伯克霍尔德菌引起全身感染伴肝脓肿；
2、布鲁杆菌引起腰椎感染；
3、荚膜组织胞浆菌致肺部感染；
4、嘴突脐孢霉致美国暴发罕见真菌性脑膜炎。