河南省大肠杆菌O157：H7感染性腹泻的流行病学调查研究
河南省卫生防疫站 张 锦 夏胜利 王建丽 马 宏
睢 县卫生防疫站 沈刚健 陈振东 黄培章 徐 强
技 术 指 导 傅炳南 涂光理
[摘要] 目的 调查大肠杆菌O157：H7感染性腹泻的分布特征、临床特点、家畜、家禽的带菌状况及外环境污染程度。方法 用现患调查方法，描述大肠杆菌O157：H7感染性腹泻的发病情况，分析引起流行的原因，应用分子生物学、微生物学、细胞学技术进行病人、家畜、家禽的病原学分离、培养、毒素因子测定。结果 睢县是我省首先发现的的疫区，从3月17日～7月6日共发生病人35例，合并急性肾功能衰竭32例，死亡28例，病死率88.33%，60岁以上发病占91%；家畜、家禽携带病原体达26%，以波尔山羊带菌率最高30 %。共检出各类毒素因子组合型大肠杆菌O157：H7 99株，其它大肠菌6株，含有毒素基因67 株，显示有5个毒素因子组合型。 结论 大肠杆菌O157：H7感染性腹泻并发急性肾功能衰竭是病人死亡的主要原因，家畜、家禽的高带菌率可通过污染水、食物传染给人，亦可通过蝇和日常生活接触感染。
[关键词] 大肠杆菌O157：H7 发病率 病死率
2000年6月，我省睢县报告了2例原因不明的急性肾功能衰竭死亡的病人。依据临床表现，疑为出血性大肠菌引起的溶血性尿毒综合症。为了查明病因及流行现状，在省卫生厅的领导下，我站立即成立了流行病学调查组和试验诊断组(包括微生物检验、PCR扩增检测、vero细胞毒测定、溶血试验)，对发生的疫情开展了一系列的调查研究和试验室证实工作。调查结果表明，这可能是一起由大肠杆菌O157：H7感染为主的出血性结肠炎并发HUS的暴发疫情，现将调查结果报告如下：
1.调查对象和方法
1.1. 可疑病因分析 调查肾衰病人发病前、病中、愈后等情况，填写统一的调查表。
1.2. 病原学调查 对疫区内腹泻病人、疑似住院病人进行病原学分离。1.3.LPS抗体测定 对病人用纯化的O157脂多糖抗原进行蛋白印记试验。
1.3. 家畜、家禽携带大肠杆菌O157：H7情况调查 选择了睢县引进的新西兰波尔山羊养殖厂做为监测点，对羊群的入境、繁殖和现状进行了调查；同时对发病较多的蓼堤乡彭寨、刘寨、大岗和未发病的董店王集村进行家畜、家禽的带菌调查，在调查的同时也对部分外环境如餐具、蝇的污染情况以及食品进行了调查。
1.4. 实验室检查
1.5. 粪便培养 对现症腹泻病人、疫区家畜、家禽、病家外环境采样检测，标本5g加入40mlmEc增菌液增菌14小时、免疫磁珠法集菌后，接种科玛嘉平板，16-18小时后，挑取淡紫色及不同生长形态菌落进行玻片血清凝集并接种K氏双糖培养基36℃培养过夜。血清凝集者再进行系统生化鉴定。mEc增菌液由上海试剂供应研究中心生产，批号99-09-23；免疫磁珠、磁板由挪威Dynal.A.S公司生产,批号 B55910；CHROMagr琼脂由法国产品,博赛科技有限公司提供；诊断用血清由上海市疾病控制中心、中国医学科学院流行病研究所、北京天坛生物制品检定所和美国NIH供给，均在有效期使用。全自动生化分析仪由法国梅里埃公司生产，GNI+生化鉴定卡批号为M115A.
1.6. PCR扩增法： 取粪便1g加8～10mlLB肉汤培养6小时，取1ml培养肉汤，离心收集细菌，1ml生理盐水洗涤一次，细菌沉淀旋浮于100μl无菌蒸馏水中，100℃煮沸10分钟，离心取10μl。设计扩增出血性大肠菌的O157、O111、hlyaA、eaeA、stx1、和stx2六种毒素基因的12对引物，加入dNTP、Mg++?、PCR缓冲液及Taq酶进行PCR扩增反应，反应总体积25μl，循环扩增完毕，取10μl扩增物与2%琼脂糖电泳，溴化乙锭紫色紫外光观察判断结果。
1.7. vore细胞毒测定：挑取16小时培养后的可疑菌落，接种5ml肉汤，37℃过夜，取1ml肉汤培养物，每管加50万u/ml多粘菌素B 10μl，37℃水浴30分钟，10,000rpm/分钟离心15分钟，取上清加入2天龄Vero细胞内，放CO2培养箱，连续三天观察结果，设阴阳对照，凡有75%以上的细胞发生病变时，判为阳性。
1.8. 溶血素检测：无菌抽取绵羊血、玻璃珠脱纤维用0.01molPBS洗3遍后备用。血平板制作：95ml营养脂肪加4ml羊血，加1ml氯化钙水溶液(1mol/L)，用接种针挑取已培养好的新鲜培养物刺入血平板，第二天观察结果，以针刺周围有套管样溶血环者为阳性。
2.结 果
2.1.疫情概况 睢县位于河南东部，距郑州156公里，属商丘市辖县，也是我省贫困县之一，全县人口76万，设24个乡(镇)，546个行政村，1169个自然村。疫情的发现和调查是通过疫区报告病例、入村调查的基础上对可疑病人进行逐个登记和个案调查，截止7月6日，全县共发生可疑病例35例，血清学确诊8例，并发急性肾功能衰竭32例，死亡28例，肾衰病死率80.32%。
2.2.肾衰病人临床表现 多数病人发生肾衰前均有腹泻史，腹泻以水样便多，经村卫生室或乡镇卫生院用抗菌素治疗，症状有所好转，腹泻停止平均5天后出现少尿、无尿等急性肾功能衰竭症状，部分病人在临床上同时伴有多器官损害，病程进展迅速，临床疗效差，从急性肾衰到死亡平均4.93天(表1)。
表1. 32例肾衰病人主要临床表现
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大 便 性 状 发热 腹疼 呕吐 恶心 浮肿 N症状 呼衰
水样 血水 脓血
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16 5 11 11 26 25 25 2 2 3
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首发病例：韩学玲，女，53岁，睢县蓼堤乡尖庄村人，3月17日发病，呈水样便，3月24日以头晕，纳差，恶心，呕吐伴少尿入商丘市第一人民医院。4月3日因急性肾功能衰竭，呼吸肌麻痹死亡，（血肌酐入院时为287μmol/L，死亡前为1,300μmlo/L）死亡诊断为：急性肾功能衰竭、格林巴利综合症。在病人的病历档案中，一位资深的内科大夫曾记录这样一段话：患者发生急性肾功能和格林巴利综合症是以往从未见到过的，值得引起我们的重视。
病历二：陈世忠，男，46岁，睢县蓼堤乡杨庄人，病前身体健康，4月16日发生水样腹泻，伴腹痛、发热，在村卫生室村医给予小诺霉素1.2g、维生素B6、环丙沙星100ml、甲基异口恶唑250ml加入10%的葡萄糖静脉滴注。第二天好转后进城收木料，半路上腹痛难忍，又到县医院看病，诊断为兰尾炎，给予青霉素肌肉注射，第三天发现少尿，第四天出现无尿拌腹胀，医院又按肝硬化腹水治疗无效，转商丘市第一人民医院，以水肿少尿四天、急性肾功能衰竭，收入院，曾利尿、血液透析治疗,随后出现听力下降，语言不清，呼吸困难，临床诊断为急性肾功能衰竭、格林巴利综合症，于4月19日自动出院转北京治疗，4月20日死于北京。
病历三：高树廉，男，68岁，睢县长岗乡高庄人。6月5日发病，鲜血样大便，伴满腹阵发性痛疼，恶心、呕吐、发热，由儿子(中医院内科大夫)经氟哌酸口服，丁胺卡那霉素静脉滴注后腹泻好转，6月10日晚出现少尿，6月11日无尿，由睢县转郑州河南医科大院附属二院内科治疗，经腹透、血透效果欠佳，6月22日死于急性肾功能衰竭。经中国预防医学科学院流研所LPS蛋白印记试验IgM、IgG呈阳性反应。
微生态制剂的预防作用：
健康与疾病是宿主与环境对立统一的两个矛盾的侧面。正常微生物群对其宿主的健康负有重要责任，可以说对宿主保持健康，增强体质，防御疾病的功能起重要作用，也对宿主和环境保持平衡中起重要作用。人的肠道菌群是比较稳定，除非患病或用药干扰等因素使之发生紊乱，一般是能够保持动态平衡。正常微生物群与宿主有共生关系，对宿主有免疫、营养、拮抗外袭菌、维持微生态平衡等作用，当这种平衡遭到破坏时，就意味着宿主生病，宿主生病也造成肠道正常菌群的改变。
微生态制剂不同与其它的药物，它可克服使用抗菌素所造成的菌群失调，耐药菌株的形成和其它毒副作用。使用微生态制剂的作用主要有凋整微生态失调、生物拮抗、代谢产物改善理化环境、免疫作用。在肠道内嗜酸乳杆菌等生理性细菌占肠道菌群总数的90%以上，在肠道发生细菌性感染时，嗜酸乳杆菌等肠道正常菌群的数量下降，失去平衡，嗜酸乳杆菌可通过恢复肠道菌群平衡，对细菌性和病毒性腹泻起到非特异性预防和治疗作用，机理是通过恢复肠道的微生物生态平衡，提高肠道对病原菌的定居阻力，促使病原菌的排出来实现的。中国预防医学科学院流行病学研究所进行了大量实验室研究，并证明：嗜酸乳杆菌具有提高免疫动物对病原菌攻击的抵抗力和特异性抗体水平，能够抑制志贺氏菌、致泻性大肠杆菌对上皮细胞的黏附，该菌株对Hep-Z细胞黏附平均达222.48±30.7个细菌／细胞，可将产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠杆菌F171菌株的黏附和侵袭菌数分别由273.4±24.7个细菌／细胞，降低到65.3±13.1个细菌／细胞，将侵袭性大肠杆菌8401菌株对Hep-Z细胞的黏附和侵袭数分别由269.2±26.5个细菌／细胞和34.0±5.3个细菌／细胞下降到70.7±14个和6.82±2.9个细菌／细胞，嗜酸乳杆菌DOMla菌株对致泻性大肠杆菌上皮细胞黏附和侵袭力具有非特异性的抑制作用，且无副作用。在疫区内对高危人群口服嗜酸乳杆菌胶囊可以有效的防止健康人因肠道菌群失调导致O157：H7的感染发病。同时对病原感染者起到抑菌排菌作用。对于健康人的使用可以按每天3粒，连服三天，一月后再按此方案重服一次。 |
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