宏基因组学在病原体检测的优势与不足

细菌耐药

我今天上午在本贴介绍了宏基因组学技术，相关链接如下：

1. [进展] 你知道宏基因组学技术吗？
https://bbs.sific.com.cn/thread-104950-1-1.html

2.[进展] 宏基因组学专著推荐：Metagenomics Methods and Protocols
https://bbs.sific.com.cn/thread-104951-1-1.html

围绕宏基因组学技术，在大家学习完以上材料后，我提出以下几个学术问题，请大家积极参与讨论：

1. 在病原体检测方面，宏基因组学攻克了怎样的难点？（比如为何可替代实验室培养）如何攻克的？
2. 在病原体检测方面，宏基因组学有哪些优势？潜力何在？
3. 目前存在哪些不足？

由于这是一个很新的技术，学习起来难度较大，希望版主可以对回贴参与讨论的人员加分鼓励啊，谢谢！

欢迎大家积极参与讨论！

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几天下来，这个帖子没有人回贴呀，我想，一是由于这个技术很新，大家不了解；二是我提供的所有的资料都是英文的，大家学习起来难度较大。但是没有办法，最新的技术、最新的进展，我们能拿到的资料，往往都是英文的。

利用假期的休息时间，我想好好读一读JAMA上的这篇文献，稍后会将我的学习所得发上来与大家分享。

JAMA. 2013 Apr 10;309(14):1502-10. doi: 10.1001/jama.2013.3231.
A culture-independent sequence-based metagenomics approach to the investigation of an outbreak of Shiga-toxigenic Escherichia coli O104:H4.

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摘要学习的体会

Importance：
JAMA摘要中开头有一个Importance，这个我很喜欢，短短一两句话，却道出了本文的最大亮点所在。作者指出，在感染暴发中，病原菌鉴定至关重要，而传统的基于培养的方法比较困难，尤其是当暴发菌株没有相应的特异性检测试验时。这个我比较能够理解，比如，目前对Shiga-toxigenic Escherichia coli (STEC)等肠道病原体鉴定，主要依据血清学诊断试验，但是如果是一个新的亚型，就没有相应的抗体来进行检测了。

Objective：
探索一个具有潜在应用价值的宏基因组学技术，该技术可直接应用于微生物样本，进行DNA提取与测序，从而在暴发感染中不依赖培养技术而进行鉴定。

Design, Setting, and Patients：
采用回顾性研究，收集45株2011年德国暴发的Shiga-toxigenic Escherichia coli (STEC) O104:H4的粪便样本。样本直接进行高通量测序（2012年8月-9月），接下来进行三个阶段的分析（2012年9月-2013年2月），阶段1：得到暴发菌株的基因组的基本信息；阶段2：得到每个样本的基因组信息；阶段3：DNA序列比对鉴定暴发菌株。

Main Outcomes and Measures：
所得到的基因组序列可用于暴发菌株及样本中其他菌株的鉴定

Results
通过阶段1得到了暴发菌株的基因组序列的基本信息；通过阶段2，在26个样本中检测到暴发菌株的序列，在40份STEC阳性样本中，27份检出Shiga-toxin genes；在阶段3，还检出Clostridium difficile, Campylobacter jejuni, Campylobacter concisus, 和Salmonella enterica的基因序列。

Conclusions and Relevance：
宏基因组技术是一种不依赖培养的对腹泻性疾病暴发中的病原菌鉴定的一种方法，该技术存在的挑战是：需要提高诊断灵敏度、加快速度、简化检测流程和降低费用。

蓝鱼o_0

这个确实比较新，了解也不深，把文章下来看看，学习学习，五一期间，闭了个关，就发现落后了。

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蓝鱼o_0 发表于 2013-5-1 18:10

                               
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这个确实比较新，了解也不深，把文章下来看看，学习学习，五一期间，闭了个关，就发现落后了。

在5天前，我已经上传了本文的全文。

https://bbs.sific.com.cn/thread-104950-1-1.html
（本贴6楼有全文）

谢谢关注！

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introduction中对传统培养方法的缺点进行了阐述，并简单介绍了宏基因组学技术。

传统的对暴发菌株的鉴定，依赖实验室先分离到纯培养的菌落。而实验室的体外培养和分离常常比较缓慢、困难，甚至是无法培养。如果暴发菌株不属于已知分类和亚型的菌株，则没有相应的特异性血清学诊断试剂，鉴定非常困难。比如，德国的暴发感染中，就是一个新的血清型（STEC O104：H4），以前没有报道过，因此，通过实验室的标准检测流程就无法进行该菌株的鉴定。

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本实验所采用到的检测流程图如下

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暴发菌株的基因测序结果

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暴发菌株临床特征、传统检测方法与宏基因组学测序结果对比表

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暴发菌株临床特征、传统检测方法与宏基因组学测序结果对比表（续）

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采用宏基因组技术不仅检测出了SETC菌株，还检出了很多其他菌株，见此表。

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几个相关的概念：

基因组学（genomics）
随着人类基因组计划的实施而诞生,现已成为后基因组时代一门重要的生命科学学科.研究者已经逐渐习惯于在对生物体的个别基因或蛋白质研究之前,先测定或分析该物种的基因组序列.目前已经知道全基因组序列的真核生物有40多种,而原核生物则多达200多种.这些工作表明,研究人员在基因组序列分析方面已经取得了巨大的进展.但是,对于自然界现存的物种而言,人类所测定的物种依然是少之又少.在原核生物世界中,仅仅是被命名的就达到5700种,而那些未知微生物的种类则可能多达上百万种。

宏基因组 (也称元基因组学， Metagenome)
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词, 其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature” , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因, 目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

宏基因组学 (元基因组学， metagenomics)
就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象, 以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段, 元基因组学（ Metagenomics）通过非培养方法进行微生物群落组成的鉴定,主要技术包括DNA的提取、文库的构建和目标基因克隆的筛选和元基因组直接进行高通量测序分析,可用于发现新基因、开发新的生物活性物质、研究群落中微生物多样性和基因组成与功能预测等方面。 以微生物多样性、种群结构、 进化关系、 功能活性、 相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。

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刚刚检索到丁香园对JAMA这篇文章进行的分析与报道，发上来与大家分享一下：

病菌菌株的鉴别对于流行性疾病暴发的控制至关重要。然而，传统的基于细菌培养的诊断方式却困难重重，特别是当不存在爆发毒株的特异性诊断检验方式时更是如此。宏基因组学方法从多种微生物混杂样品中提取DNA直接用于测序，被认为是一种不需要实验室培养即可完成爆发菌株鉴定的无限制临床检验平台。为了探索宏基因组学的潜在价值，英国伯明翰大学微生物感染研究所的Loman NJ博士等人进行了深入研究，他们发现在某一腹泻性疾病爆发时，宏基因组学具有作为无限制的、独立于培养的、用来识别和描述细菌性病原体特征方法的潜力。所面临的挑战包括加速及简化工作流程、降低成本及提高诊断的敏感性，而所有这些可能转而依赖于基因测序技术的改善。相关论文发表于国际权威杂志JAMA 2013年4月最新一期在线版。

在该项回顾性研究中，研究者选择了2011年德国产志贺毒素大肠杆菌(STEC) O104:H4毒株流行时的45例腹泻患者粪便样本并进行了分析。样本经3期分析后送交进行高通量测序（2012年8月至9月）。1期分析中，研究者利用从头测序方法得到了流行菌株的基因组草图。2期分析中，研究人员鉴别了每个样本中爆发菌株基因组覆盖的深度。3期分析中，每个样本的测序结果都与其他未知菌株作比较，以鉴定出那些属于非流行菌株的病原菌。主要结局为以基因组测序数据的覆盖率进行粪便样本中流行菌株的鉴定和特征描记。

结果显示，在1期分析中，得到了STEC流行菌株的基因组草图。2期分析中，研究人员以大于10倍的覆盖范围从10个样本中找到了该爆发菌株的基因组，并在26个样本中以大于1倍的覆盖范围找到了该爆发菌株的基因组。研究人员在40例STEC-阳性的样品中发现有27例（67%）含有来自志贺毒素基因的序列。在3期分析中，研究人员找到了难辨梭状芽孢杆菌、空肠弯曲菌、简明弯曲菌及肠道沙门氏菌的基因序列。

该研究用宏基因组学（对从复杂的微生物样品中提取的DNA进行直接测序）对2011年德国产志贺毒素型大肠杆菌爆发所做的分析中，研究人员成功地对一个疾病爆发菌株的基因组序列进行了重建；这些结果表明用这种方法具有比基于细菌培养的方法更快识别并描述细菌性病原体特征的潜力。

研究人员最终得出结论，在某一腹泻性疾病爆发时，宏基因组学具有作为无限制的、独立于培养的用来识别和描述细菌性病原体特征方法的潜力。所面临的挑战包括加速及简化工作流程、降低成本及提高诊断的敏感性，而所有这些可能转而依赖于基因测序技术的改善。

相关链接：
http://gi.dxy.cn/article/51262?keywords=宏基因组学

细菌耐药

宏基因组学（Metagenomics）技术不依赖传统的微生物分离培养过程，以高质量的环境样品总DNA为研究材料，以DNA深度测序和功能基因筛选为研究手段，高通量识别复杂环境样品中微生物的结构组成及功能。

其主要技术优点有：

■ 进行不可培养微生物的功能研究

■ 每条序列可以代表样本中的一个基因

■ 高通量测序，能够获得低丰度细菌的功能信息

■ 可构建不同细菌之间协同的代谢网络

鬼才

真正感到落后于时代了。不说基因组学，就是生物化学也是我的一软肋，在今年年会前我就有这一感觉，发现自己要做好感控工作，还有许多知识要学。
落后的滋味对我来说是很不好受的。

细菌耐药

正在学习宏基因组学技术的一些课件，挑一些好的发上来，与大家一起学习，一起讨论。

宏基因组学的基因概念

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宏基因组学的研究目标与意义，不过对临床微生物检验人员来说，我们关注的是其用于病原菌的检测和鉴定的价值。

细菌耐药

那为什么要进行宏基因组学研究呢？这张片子分析得很好。

细菌耐药

什么是微生物基因组学呢？

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宏基因组学的广义概念