【感染科普笔记2024-9-9】逄宇丨分子检测技术在结核病患者早期发现中的作用

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讲者｜逄宇（首都医科大学附属北京胸科医院）
整理｜万艳春（江苏省淮安市第一人民医院分院）
审核｜秦海燕（昆明市第一人民医院）
来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会
结核病是我国乃至全球都面临的一个重大公共卫生问题，世界卫生组织提出到2035年终止结核病的远期目标，但要达到这个目标，我们需要改变现有的被动发现策略，实行主动发现、早期发现策略，这就离不开创新性新技术的成功研发和推广应用。SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会上，首都医科大学附属北京胸科医院的逄宇教授介绍了分子检测技术在结核病患者早期发现中的作用。



一结核病负担依然严重
结核病是一种传染性疾病，目前全球有近四分之一（约20亿）的人感染结核分枝杆菌并长期处于潜伏感染状态。结核病是目前面临的一个重大公共卫生问题，世界卫生组织提出了2035年要终止结核病的一个远景目标，这个目标实现起来困难重重，必须依靠创新性的防治技术和积极主动的发现策略。二创新性的防治技术和积极主动地发现策略
开发、研制和迅速利用创新技术，实施主动发现策略，早期诊断患者，加快结核病患者的早期发现，有效减少结核病在社区人群中的传播，终止结核病流行。
（一）结核病实验室诊断技术，见表1。
表1 结核病实验室诊断技术分类及特征


近年来，在结核病的实验室诊断方面，分子生物学检测技术应用得越来越多，在很多重大的新突发传染病诊治过程中，分子生物学诊断也发挥着越来越重要的作用。
（二）主动发现患者策略分享一个来自北京市的结核病患者主动发现的研究项目，见图1。


研究中为了既兼顾患者发现，又能够最优成本效益，对纳入研究的标本实施了混检。为了达到最佳的混检效率，提高灵敏度的同时最大程度地提高患者发现率，研究者进行了多次的配比试验，最后应用1:5即一份阳性痰4分阴性痰的配比方案，它不影响患者发现率，可以达到较好的效果。这种主动筛查策略比较符合成本效益。经过混检后再次进行个体检测，最终研究发现4名患者确诊结核病。4名阳性患者均为中老年人，其中2名无咳嗽咳痰等临床症状，摄片检查只有1名异常，这些研究结果说明常规的筛查手段和被动的发现策略不能满足结核病筛查的需求。见表2。
表2 主动发现患者的特征


三不同标本在结核病诊断中的作用
痰标本是肺结核检查最主要、最有利于诊断的标本类型。但全国的结核病流行病学调查信息显示结核病患者中无症状比例较高，见表3、表4。
表3 2000年与2010年调查中活动性肺结核患者的肺结核症状


表4 2000年与2010年调查中涂阳肺结核患者的肺结核症状



对于无症状患者，无痰成为主动发现患者的主要挑战，部分患者处于结核病早期，咳嗽症状不明显，无法获得有效的痰标本；部分特殊人群不会排痰，比如儿童等。寻找替代痰标本的适宜标本类型迫在眉睫，目前研究有肺泡灌洗液（BALF）、大便、胃液、深喉唾液、舌拭子等标本。
（一）支气管灌洗液标本用于肺结核的诊断一项研究中，440例疑似肺结核患者被连续纳入研究，从每位患者身上采集三份痰标本，分别进行涂片检查、GeneXpert MTB/RIF检测和分枝杆菌培养三种方法检测。
检测后GeneXpert阳性155例，82例确认其他疾病，但仍然有182例GeneXpert阴性的患者无法明确诊断，按照临床路径对这些患者留取灌洗液标本以明确是否为活动性结核病患者。研究结果显示，痰标本GeneXpert MTB/RIF检测的灵敏度达94.1%，而支气管灌洗液标本可以在痰标本GeneXpert MTB/RIF检测阴性的182例患者中再检测出77例阳性患者，说明支气管灌洗液标本进行GeneXpert MTB/RIF检测可以显著地提高痰标本检测阴性患者的阳性率，其灵敏度达97.4%。需要注意的是痰标本的质量会影响检测结果，提示大家要关注提高痰标本的质量；同时如果痰标本质量不高时，支气管灌洗液标本可能是一种重要的潜在的替代痰标本的适宜标本类型。
（二）粪便标本用于肺结核的诊断世界卫生组织已经推荐把粪便标本用于儿童结核病的早期诊断，最早是美国研究人员开展的一项研究。见图2。



从研究结果中可以看出，使用粪便PCR方法检测阳性率虽然不是很高，但是可以作为一个重要的补充。此外，在105个无症状的密切接触人群中，使用粪便PCR方法检测阳性率也会增加，通过这个研究提示粪便标本也可以进行肺结核诊断。
相比于传统的痰标本、支气管灌洗液的标本而言，粪便标本的前处理需要关注。最新的一项研究就是比较了粪便两种前处理的过程和其对检出的影响。
粪便前处理方法A：将0.8g粪便倒入SR*瓶中→两次，摇30秒，静置10分钟→将2毫升“无残渣”上层清液放置于Xpert Ultra盒中。
粪便前处理方法B：将1.0g粪便转移到10mlPBS%中→摇10秒，静置15分钟→将1毫升“无残渣”上层清液放置于1mlSR*缓冲器中→将2毫升放置于XpertUltra盒中。
方法B是传统的前处理方法，方法A是优化后的前处理方法，图3反映了优化前后的检测结果。



图3显示使用不同的处理方法后检出的情况，纵坐标是使用经典传统的方法即B方法，不同颜色代表使用优化后的A方法患者发现的阳性及载体量情况。A方法相比较于B方法有2个标本没有检出，但是有2个标本是在传统的方法漏检或无效的结果时，仍然可以检测出阳性。所以粪便前处理的方法优化后可以适用于结核病的早期诊断，粪便标本是儿童、重症J结核病患者分子诊断的潜在标本类型。
（三）胃液标本用于肺结核的诊断胃液标本的研究最早在2013年，见图4和表5。




结核分枝杆菌本身是一个抗酸杆菌，但是这种抗酸能力有限，在胃液这种强酸长时间的浸泡之下，它的活性也会受到显著影响。而相比之下分子生物学检测的影响会小一些，所以目前胃液标本主要是用于儿童结核病早期诊断的检测。
（四）深喉唾液用于呼吸道病原体检测的潜在价值深喉唾液和唾液不一样。唾液是舌下的唾液腺分泌的，而深喉唾液像清嗓子时喉部产生的分泌物。最早在新冠流行时，分别使用咽拭子和深喉唾液检测病原体，对不同患者、不同时间进行病毒载量的监测，结果发现两种标本类型的病毒载量呈现出高度平行性，反映出来两个标本之间呈现出高度的一个相关性，所以深喉唾液当时是作为一个呼吸道病原体的重要的痰标本替代类型。通过新冠检测的依据，研究者试图对无痰或者病毒载量极低的人群，将深喉唾液应用于结核病早期诊断，结合灵敏的检测技术，研究者在全国三家中心开展了一项多中心的基于深喉唾液联合Ultra用于无痰结核患者诊断研究，见图5。



结果显示，682例患者中有227例是传统的支气管灌洗液标本明确诊断，其中有179例通过深喉唾液检出，检出率大概80%左右。在417例传统方法诊断阴性中，使用深喉唾液标本多发现15例阳性患者，提示深喉唾液联合高灵敏度的分子生物学检测方法是一种很重要的潜在的标本类型。研究发现，最高的检测灵敏度来自BALF和X-Ultra联合检测，但是排在第二位的并不是现在大家广泛应用的BALF和X-Classic的联合，而是使用深喉唾液联合X-Ultra，深喉唾液联合Ultra的检测性能优于BALF联合Xpert的常规路径。这提示深喉唾液未来可能也成为潜在的重要的标本类型，它联合高灵敏度的分子生物学检测是一种很重要的患者早期发现或者替代标本检测的类型。
（五）舌拭子用于肺结核的诊断多项研究数据显示的结果类似，使用舌拭子标本联合高灵敏度的分子生物学检测可以发现大概70%-80%的痰菌阳性患者，提示舌拭子在未来的主动筛查或者患者的主动发现中具有很重要的价值。
最后，值得注意的是，各类标本的菌量与诊断准确性有一定的关联。研究发现，菌量极低的时候，对于耐药性的诊断可能会有一定的影响，这也是分子生物学检测诊断不太确定的原因。
小 结分子生物学技术的进步促进了结核病的实验室诊断的不断革新。标本前处理的标准化及低菌载量产生的假阳性问题值得关注。基于分子技术的患者主动发现策略的系统研究将成为未来的重要热点。
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