【感染科普笔记2023-12-26】杨启文丨临床微生物进展年度TOP10

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讲者丨杨启文（北京协和医院）
整理丨刘水桂（南昌三三四医院）
审核丨刘欢（襄阳市中心医院）
来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会
临床微生物是临床与实验室紧密结合的学科，随着研究水平的提高和科研人员的密切关注，近年来临床微生物学取得了飞速发展。北京协和医院的杨启文教授在《临床微生物进展年度TOP10》一文中对国内外临床微生物学领域的人类微生物组与疾病的相关性以及EUCAST、ELSI的更新内容进行详细的介绍，为相关科研人员和临床工作者了解最新科研动态和明确研究思路，提供一定的指导意见。



一、肠道菌群与人体疾病
（一）肠道菌群与癌症
《微生物与人类癌症》这篇综述从现代癌症生物学和免疫学角度对这一证据进行了批判性的评估，从机制、诊断和调控策略的进展情况来描述微生物在癌症发生中的作用。在癌症发展过程中，很少有微生物直接导致癌症，但许多微生物似乎参与了癌症的生长，通过宿主的免疫系统发挥作用。然而，与癌细胞相比，肿瘤内微生物细胞的丰度较低，对其功能谱系和效力的了解仍有限。

（二）研究癌症相关微生物的实验设计
从纵向队列和多区域采样开始，有机会对癌症相关微生物群的存在和功能进行大规模鉴定。现有工具可用于收集宿主免疫细胞、癌细胞、微生物群和代谢物的多组学信息，然后可用于验证或反驳特定微生物（或其代谢物）的预测功能影响和机制及其在致癌试验中的因果关系。

（三）肠道微生物胆汁酸与人体疾病的关联
2023年5月发表的《基础和临床胃肠病学和肝病学综述》报道，胆汁酸可以通过激活肝脏和肠道中的受体，调节血糖水平、胆固醇代谢和免疫信号等。肠道菌群和胆汁酸之间的相互作用对于人体的健康和疾病的发生、发展和治疗具有重要意义。

（四）人体微生物组研究的报告指南由微生物、流行病学研究人员组成的一个多学科小组调整了观察性研究和遗传学研究的指南，使其适用于与文化无关的人类微生物组工作室，同时还开发了针对微生物组研究的实验室、生物信息学和统计分析报告要素。

二、猴痘病毒
（一）猴痘病毒2022年流行状况
2022年5月以来，在猴痘非流行国家报告出现猴痘病例，且在几个流行国家不断有猴痘病例报告。大多数有旅行史的确诊病例报告去过欧洲和北美国家，而非存在猴痘病毒流行的西非或中非。

（二）经典猴痘和2022年猴痘的区别
以往的猴痘病例集中在中非和西非一些地区的零星暴发，当地的一些啮齿类动物可能是猴痘病毒的天然宿主，而人与野生动物的接触导致这些地方猴痘不断反复。2022年之前的猴痘疫情，呈现的特点一是感染病例很少，二是与非洲有明确的输入关联。2022年非洲之外的猴痘病例99%的感染者是男性，其中95%以上又是男同性人群。

（三）2022年猴痘病毒的微进化
虽然2022年的MPXV与2018年和2019年的病例聚集在一个流行国家，但它分离在一个不同的系统发育分支中，不同的分支可能代表着加速进化。
一项深入的突变分析表明，宿主APOBEC3 在病毒进化中的作用以及通过脱氨酶和脱氨酶非依赖机制引入突变来抑制广泛的病毒。基因组和系统基因组数据揭示了猴痘病毒在人与人之间传播过程中的微进化迹象。

（四）2022年猴痘的遗传进化

• 猴痘有1030个MPXV基因组序列。
• 1958年至2022年9月28日间鉴定MPXV基因组数据（complete level）。全基因组系统发育树及全基因组SNPs系统发育树的分析，两种方法的结果均支持MPXV的三个不同分支（分支Ⅰ、分支Ⅱ和分支Ⅲ）。
• 分支Ⅰ代表“刚果盆地”；分支Ⅱa和分支Ⅱb代表“西非”分支；分支Ⅲ代表2017年至2022年的最新MPXV分支，分支Ⅲ起源于分支Ⅱb，可分为A、A.1、A.2、A.1.1和B.1谱系。B.1谱系与2022年5月暴发的 MPXV疫情相关。2022年5月暴发的B.1谱系显示B.1可以分为五个明显不同的亚系，5个亚系命名为B.1.1、B.1.2、8.1.3、8.1.4、和B.1.5。
  

（五）2022年猴痘不同亚型的特征性突变
分支/谱系特异性突变（鉴定标记）定义为该分支/谱系内100%的菌株共有的突变，但不属于该分支/谱系的菌株均未出现该突变。研究发现2个新的B.1谱系特异性SNP（G76478A、G169968A）。G76478A位于基因G10R（肉豆蔻蛋白）的426位，导致非同义突变 M142A，G169968A是B11R基因（Ser/thr激酶）225位的同义突变。

三、不明原因肝炎
（一）不明原因肝炎的流行病学

• 根据世界卫生组织的数据，截至2022年7月，全球35个国家共报告了1010例儿童严重急性肝炎病例，部分重症病例需要接受肝脏移植，最终22名患儿不幸去世。其中，美国和英国是病例数最多的两个国家，两国总和超过600例。
• 《自然》杂志同期发表了3篇独立的研究论文，共同将矛头指向了2型腺相关病毒（AAV2）。此前已经发现AAV2会在肝脏中复制，但尚无证据表明这类病毒会导致肝炎。此外，腺相关病毒无法独立复制，它们需要在“辅助”病毒的协助下才能完成复制，常见的辅助病毒包括人腺病毒、疱疹病毒等，这些最新研究发现，辅助病毒的共感染可能促进了AAV2的复制。
  

（二）不明原因肝炎病因学

• 有研究显示，14名不明原因肝炎患儿的血液样本13人（93%）都检测出AAV2。相比之下，健康对照组的这一比例只有3.5%。这14份样本的人腺病毒检测结果均为阳性。13名AAV2感染者同时感染了辅助病毒（例如Epstein-Barr病毒和人乙型疱疹病毒6，即HHV-6），这可能是促进AAV2复制的原因。这些患儿症状的严重程度可能与AAV2和辅助病毒的感染有关。
• 有人用PCR等技术对32例肝炎患儿的样本进行检测，其中26人中检测到AAV2（占81%），而对照组只有7%。遭受感染的儿童中大约93%携带了特定的人类白细胞抗原（HLA）基因，相比之下，对照组只有16%。这一发现表明，部分儿童更易感染某些肝炎是受到了遗传因素的影响。
• 有研究显示，28位肝炎患儿的检测分析中，发现27人含有AAV2。部分肝炎病例中检测出低水平的人腺病毒和人乙型疱疹病毒6B（HHV·6B）。这些病毒不仅可能辅助了AAV2的复制，还可能导致免疫调控引起的严重肝损伤。
  

四、癌症相关DNA病毒
随着大规模基因组测序的推出，通过规模化数据分析的方法来研究病毒-肿瘤关联的时机已经到来，利用来自RNA测序，全基因组测序和全外显子测序数据，可以为病毒、肿瘤关联研究提供丰富的资源。
研究团队建立了一种可以检测常见的人类DNA病毒的测序技术，利用其中病毒与人类基因组无法比对的reads识别病毒DNA，通过分析其在48148个临床肿瘤样本（来自51种不同病毒种类的82种独特亚种病毒分类）的测序数据，发现平均每个样本有32810个pair-reads不能比对到人类参考基因组，其中26.1%的样本鉴定出病毒DNA。疱疹病毒和人乳瘤状病毒与人类癌症相关。EB、HPV与癌症相关。
该研究是迄今为止最大和最全面的关于人类癌症中 DNA病毒检测的研究工作，证明了检测到肿瘤病毒状态以用于癌症患者常规临床管理的可行性。

五、AMR全球健康威胁
（一）疑难危重感染正严重威胁国民健康

• 社区/医院获得性感染
  

全球每年约4000万人感染，50万人因感染而死亡，中国每年约1000万人感染社区/医院获得性感染（WHO2017年报告）。因无法及时精准诊断感染病因导致治疗延误或治疗不当，加重病情甚至致死。
2.细菌耐药形式严峻
WHO保守估计到2050年全球因细菌耐药问题每年死亡人数将逾越1000万人。2016年中国提出《遏制细菌耐药国家行动计划》，2020年国家卫健委发布《关于进一步加强抗微生物药物管理遏制耐药工作的通知》，旨在加强细菌耐药的管理。
3.新发病原体层出不穷
新发病原体的不断出现，严重威胁人类健康。


（二）全球面临着严峻的常见致病菌耐药挑战

• （The Lancet）最新发表“2019年全球抗细菌药物耐药负担系统分析”，抗生素耐药菌感染是当前全球主要死因，超过了许多其他疾病的死亡原因，2019年约127万人直接死于抗生素耐药，495万人的死亡与抗生素耐药相关。
• 全球迫切需要解决抗生素的耐药问题，因为耐药问题严重影响人类抗生素的使用。
• 耐药挑战是外排泵高表达、药物通透性降低、耐药酶、靶点基因突变、生物膜。
  

六、WHO发布真菌重点病原体清单（FPPL）
（一）WHO发布真菌重点病原体清单

• 首份真菌重点病原体清单（FPPL）的颁布，旨在呼吁各国政府和研究人员做出重大努力，加强对名单上19种真菌的应对，关注并推动进一步的研究和政策干预措施，以加强全球应对真菌感染和抗真菌耐药性的能力。
• 世卫组织最终根据抗真菌耐药性、死亡率、循证治疗诊断方法可获性、年发病率、并发症和后遗症等因素对纳入的病原体进行了排序，将其分为三个优先级组。①严重优先级：新生隐球菌、耳念珠菌、烟曲霉和白念珠菌。②高度优先级：光滑念珠菌、组织胞浆菌属、真菌性足菌种病原体、毛霉目、镰刀菌属、热带念珠菌以及近平滑念珠菌。③中等优先级：赛多胞菌属、多育赛多胞、球孢子菌属、克柔念珠菌、格特隐球菌、马尔尼菲篮状菌、耶氏肺孢子菌以及副球孢子菌属。
  

（二）重点真菌病原体清单的制定原则

• 公共卫生重要性是确定优先事项的重要决定因素，4种“严重威胁”病原体是在公共卫生重要性方面排名最高的病原体（新生隐球菌、耳念珠菌、烟曲霉和白念珠菌）。
• 抗真菌药物耐药是重中之重，因此，在研发需求方面，高度耐药的真菌病原体排在首位（例如Lomentospora prolificans、镰刀菌属、毛霉目和赛多孢菌属）。
• 系统综述揭示了全球真菌感染负担和抗真菌耐药性方面的重大知识缺口。被纳入优先排序的所有19种病原体均缺乏关于疾病负担的全面数据，对于发病率的数据不全，且相关的药敏数据缺乏正规监测和与临床结局的数据关联。
• 真菌病原体分布和流行病学在不同地区有很大差异，抗真菌药物耐药性的流行率也有很大差异。
  

（三）重点真菌病原体清单的应用

• 监管
  

改进实验室检测水平主要取决于真菌学实验室的应用；提升临床诊断与监管水平则主要取决于对真菌感染的临床表现和危险因索的认知程度和教育水平，准确的诊断是正确抗真菌管理的基础。
2.研究与开发
解决IFD这一重大全球健康威胁需要增加研究资金。针对优先级别高的真菌开发新的抗真菌药物和诊断方法（Box2）。
3.公共卫生干预
对这些重点病原体感染的疾病负担（发病率、流行率和死亡率）动态监测以及耐药流行情况深入细致的了解将有助于指导临床采取合理的干预措施。在医疗和公共卫生培训方面，设立应对真菌感染的培训体系并将其纳入考核同样重要。


七、EUCAST欧洲指南更新
（一）EUCAST的折点文件说明
根据EUCAST折点，可将结果分为三种敏感性分类

• S代表指敏感，标准给药方案：如用标准给药方案成功治疗的可能性高，则将微生物归入“敏感，标准给药方案”分类。
• I代表指敏感，提高暴露量：如通过调整给药方案或提高感染部位浓度的方式提高药物暴露量后治疗成功的可能性高，则将微生物归入“敏感，提高暴露量”分类。暴露量是抗微生物药的给药模式、剂量、给药间隔、输注时间以及分布和排泄如何影响感染部位致病微生物的一个函数。
• R代表耐药：即使提高暴露量后治疗失败的可能性也较高时，将微生物归入“耐药”分类。
  

（二）EUCAST的折点文件说明

• 技术不确定区（ATU）是EUCAST提出的一个术语，向实验室提示抗微生物药物敏感性试验（AST）存在结果无法判定的警告信息。采用EUCAST的方法和折点时，MIC测定或纸片扩散可能存在这种情况。
• ATU可以由一个（或偶尔多个）MIC值或一个（或一个范围的）抑菌圈直径界定。ATU并不属于S、I和R的药敏试验分类，也不影响结果的解释。
• ATU向实验室检测人员发出警告，该数值处于结果难以解释的区域。原因是该折点位置的解释无法重复确认。ATU假设实验操作（MIC、抑菌圈直径）正确进行，而且所得数值本身是正确的。
• 对于ATU并不存在强制采取的措施，可忽略该警告，或针对该警告采取措施。进行替代试验偶尔能解决该问题，否则必须作出决定，是按检测结果报告并添加/不添加警告信息，还是不报告该结果的敏感性分类。
• 每个药物每个菌种有自己的折点表，折点表每年都会更新。
  

（三）EUCAST2023-设立折点的剂量调整
每个药物在设立折点的时候需要药物与它对应，欧洲分为高剂量和标准剂量，分别设立它的敏感折点和耐药折点。

（四）EUCAST2023-PKPD界值
它用在临床折点还未出来时，但是药学专家已经设立出来PKPD折点，先用已经设立出来的折点报告给临床，作为建议性的报告。

（五）快生长厌氧菌纸片扩散法
2023年EUCAST出台了厌氧菌纸片扩散法指南。

八、美国临床与实验室标准化研究所（CLSI）更新
（一）CLSI主要更新内容

• 折点更新 每年出来CLSI指南，我国都要翻译。
  

①氨基糖苷类药物折点变更：CLSI2023更改了庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星对肠杆菌目细菌的折点及妥布霉素和阿米卡星对铜绿假单胞菌折点。
②哌拉西林和派拉西林-他唑巴坦对铜绿假单胞菌的折点发生变更。
③血培养直接药敏试验的变化：对于肠杆菌目细菌的血培养物直接药敏试验，在纸片扩算法（KB法）中增加了美罗培南和环丙沙星的折点，分别对应8-10h和16-18h的孵育时间。对于铜绿假单胞菌的血培养物直接药敏试验，增加了美罗培南在8-10h孵育后的KB法折点。
2.抗菌药物分级：抗菌药物分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、IV级。
3.抗菌药物选择性测试及级联报告：耐药菌株和新抗菌药物。
4.试验和报告推荐更新：新增耐药菌检测要求更新、细化菌种。药敏试验方法学注意头孢地尔、黏菌素。
5.MIC质控更新：头孢布烯 、头孢布烯-阿维巴坦，头孢布烯、ledaborbactam、美罗培南-xeruborbactam、庆大雪素、Exebacase。
6.MIC法质量控制问题解决指南。
7.天然耐药。


（二）报告优先级取代ABC组分组原则
2023年药物试验报告优先级取代2022年ABC组分组原则。2023年药物试验报告分为Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级、IV级，报告的路径与原来完全不一样。原来的报告方法是把所有的药物检测，看哪些药物敏感。现在药物试验是先做Ⅰ级药物，如果满足不了临床需求，再做Ⅱ级药物，如果Ⅱ级药物满足不了临床需求，再做Ⅲ级，如此类推。
表1 2022年和2023年药物试验报告分组情况


（三）试验/报告分级和其他考虑因素
首先对第Ⅰ级抗微生物药物耐药，按照分级关联报告规则进行报告。其次对Ⅰ级和Ⅱ级抗微生物药物耐药，应根据机构参考的特定指南或临床医生的要求进行常规检测，并根据分级关联报告规则进行报告。分级报告在中国实施有一定困难(因为临床路径实施），值得探索。

（四）选择性和级联报告
选择性和级联报告的初衷是减少医生不合理高水平抗生素使用。CLSI更新将有助于临床医生更准确地选择合适的抗菌药物治疗感染，提高治疗效果，并对抗菌药物耐药问题的控制起到了积极作用。

九、质粒介导的替加环素外排泵
（一）质粒介导的替加环素外排泵
外排泵在我国农业领域发现，它是一个很重要的内容。

（二）质粒介导的替加环素耐药
tmexCD-toprJ1与MexCD1有很高的同源性。外排泵有两个特点，一是质粒介导，传播速度比较快，二是可以使四环素的MIC增加4-32倍（包括替加环素），这就解释了替加环素耐药可以横向传播。体外实验和动物实验证实外排泵是位于质粒上新发现的产物，它可以介导替加环素高水平耐药。它在鸡场的粪便中有20%阳性率，人的标本只有0.2%阳性率。

十、快速药敏
（一）血培养快速药敏
EUCAST RAST方法以欧洲药敏试验委员会（EUCAST）标准盘扩散法为基础，但对接种物进行了修改，缩短了培养时间，修改了读数说明和特定的RAST断点。
值得注意的是该方法仅对RAST进行验证，且该方法仅对传统的药敏（AST）平板孵育最长8小时进行验证。如果您需要孵育更长时间，请使用fucAst standad盘式扩散法。

（二）EUCAST2023-RAST质控
血培养阳性报警后，不用培养菌落，可以直接用血培养液去做药敏试验，最快可以在血培养报告阳性后6小时报告药敏，药敏的准确性和标准药敏的一致性达到90%以上。

（三）UCAST2023-RAST-ESBL筛查
用RAST方法ESBL产品，头孢他啶和头孢唑肟的筛查临界值分别为4.68小时和16-20小时。
同时检测头孢他啶和头孢唑肟，筛查阳性微生物（头孢他啶和/或头孢唑肟）应进行普通的确证和分型程序。

（四）UCAST2023-RAST碳青霉烯酶筛查
使用EUCAST RAST方法，产碳青霉烯酶的大肠杆菌和肺炎双球菌可在6小时、8小时和16-20小时内使用美罗培南筛选截断值进行检测。4小时培养没有筛查临界值。筛查阳性的菌体应进行普通的确证和分型程序。

（五）MALDI-TOF联合机器学习进行细菌耐药性预测
利用机器学习从临床MALD1-TOF质谱直接预测抗菌药物耐药性，该数据集结合来自4个医疗机构的30多万条质谱和75多万条抗菌药物耐药性表型。在一组临床上重要的病原体上进行了验证，包括金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和嗜酸乳杆菌。结果接收者操作特征曲线下面积分别为0.80、0.74和0.74。

小 结
临床微生物进展年度前10名分别是肠道菌群与人体疾病、猴痘病毒、不明原因肝炎、癌症相关DNA病毒、AMR全球健康威胁、WHO发布真菌重点病原体清单、EUCAST更新、CLSI更新、质粒介导的替加环素外排泵和快速药敏。EUCAST和CLSI对I定义不同，它们的及时更新将有助于临床医生更准确地选择合适的抗菌药物治疗感染，提高治疗效果，并对抗菌药物耐药问题的控制起到了积极作用。
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图文：王小虾

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