【感染科普笔记2023-12-4】探秘病原微生物专栏丨肺炎支原体那些事儿！

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作者：宋芳琳
审核：温海楠（承德医学院附属医院）/蓝雪0816



肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）形如锥形杆，长1～2μm，宽0.1～0.2μm，由三层细胞膜包绕，没有细胞壁。细胞壁永久性缺失这一点，使之区别于L型细菌（L型细菌细胞壁的缺陷是细菌对恶劣环境暂时的反应）。细胞壁缺陷也使肺炎支原体对β内酰胺类抗菌药物不敏感，同时阻止了细胞体被革兰染液着色，也是其具有多形性的主要原因。

一、肺炎支原体描述

肺炎支原体黏附于宿主呼吸道细胞，是其定植和感染的前提。P1黏附素和其他辅助蛋白介导的细胞黏附，随后引起了慢性炎症反应和过氧化氢介导的细胞毒作用，这一作用类似于溶血素。肺炎支原体刺激B淋巴细胞和T淋巴细胞，诱导一系列自身抗体的形成，这些自身抗体与宿主各种组织和红细胞Ⅰ型抗原反应，红细胞Ⅰ型抗原与冷凝集素的产生有关。ADP-核糖基化毒素与百日咳毒素S1亚单位具有显著的序列同源性，现在被称为社区获得性呼吸窘迫综合征（CARDS）毒素，该毒素引起培养的宿主细胞空泡化和纤毛停滞，该毒素已在肺炎支原体中发现。小鼠模型已经表明支气管肺泡灌洗液中CARDS毒素浓度与特定肺炎支原体菌株的定植、生长、复制、繁殖能力直接相关，并导致肺组织病理学改变。这种菌株间的差异性可以预测肺疾病患者病情的严重程度。CARDS毒素也被用作聚合酶链反应（PCR）的靶点或者血清学检测的抗原。肺炎支原体可在出生时或在子宫内经呼吸道气溶胶或胎粪发生母婴垂直传播，甚至经移植组织发生医院感染。肺炎支原体是《人间传染的病原微生物名录》中的第三类病原微生物，应在生物安全二级(BSL-2)实验室的Ⅱ级生物安全柜内进行检测。

二、肺炎支原体临床意义

20世纪60年代早期，人类首次发现并描述了肺炎支原体，在此之前，肺炎支原体被认为是一种病毒。肺炎支原体引起约20%的普通人群的社区获得性肺炎，而在某些特定人群中多达50%。长期以来，肺炎支原体被认为与学龄儿童、青少年和中青年所患肺炎有关。但近年来发现，它在老年人和5岁以下儿童中亦可发生局部和偶尔的流行。此病原体感染最典型的临床表现为支气管炎，常伴有上呼吸道感染症状，如急性咽炎。约1/3的感染者可发展为肺炎，潜伏期一般为2～3周，家庭内传播常见。肺炎支原体在感染后滞留于呼吸道的时间可达数年，原因可能是病原体紧紧地黏附或侵入上皮细胞。该疾病无季节性，症状不明显或轻微，但需要住院的严重感染甚至死亡病例已有报道。

肺炎支原体可引起气管支气管炎、肺炎、咽炎、肺外并发症，宿主是人，通过接触感染性气溶胶或污染物传播。肺外并发症包括脑膜炎、上行性麻痹、横断性脊髓炎、心包炎、溶血性贫血、关节炎和皮肤黏膜损害。自身免疫性反应在肺外并发症中发挥一定的作用。已从脑脊液、心包液、滑膜液及其他肺外部位分离到肺炎支原体，有文献报道用PCR方法也检测到该病原体直接侵袭的证据。仅凭临床特征不足以与其他常见细菌引起的肺部感染相区别，尤其是肺炎衣原体所致的感染。临床研究及动物模型实验显示肺炎支原体可能是支气管哮喘的病因，或是病情恶化的原因。此外，临床研究表明它与疾病持续存在和加重有关。

三、诊断性试验

• 镜检：体液经DNA荧光染料（赫斯特33258或吖啶橙）染色后可能被检出，但不特异。
• 抗原检测：肺炎支原体抗原快速检测方法始于20世纪80年代，但因其敏感度低，且与其他共生支原体存在交叉反应，而使发展受阻，不建议用于诊断。
• 分子生物学检测：PCR体系已用于检测所有感染人类的有临床意义的支原体，这主要是因为它优于培养和血清学方法，例如，可以在1天内完成单个标本中不一定存活病原体的检测，可以检测贮藏组织中的核酸。比起血清学检测，PCR可以在疾病的更早期检测到病原体，因为抗体需要随着病程的发展（可能是几天或者数天）才能达到可测浓度。实时荧光定量PCR是目前首选的检测支原体的PCR法，其优点包括更快的周转时间，更少的PCR产物处理步骤以及比传统PCR技术更好的诊断敏感度。实时荧光定量PCR的分析敏感度一般很高，当使用纯化的DNA时，有些具有检出单个病原体的能力。
  
  临床标本中肺炎支原体PCR检测的靶基因包括16S rRNA、P1、tuf、parE、dank、pdhA、ATP酶操纵因子、CARDS毒力基因（mpn372），以及非编码重复原件repMp1。常规和实时以核酸序列为基础的扩增（NASBA）均已被用于肺炎支原体RNA的检测。NASBA可以快速获得敏感度与PCR一样高的结果，检测阈值低至5~50CFU。用培养和（或）血清学方法与PCR技术作比较，最终的检测结果并非完全一致。PCR检测为阳性而培养阴性，无呼吸系统疾病，可能意味着PCR法特异性不够，或感染后病原体持续存在，或是无症状携带者。PCR阳性而血清学阴性，可能是免疫应答不足，或标本是在特定抗体尚未合成时采集的。PCR阴性，培养或血清学阳性，则很可能是PCR检测过程中抑制剂的干扰或其他技术问题。用不同靶基因的二次PCR测定有利于结果的解释和解决这些差异，这在培养和（或）血清学检测结果为阴性时尤为重要。如果已经进行了抗支原体药物治疗，即使血清学结果为阳性，PCR结果也可能是阴性。有证据表明，用PCR方法检测肺炎支原体时，鼻咽标本比咽拭子更常发生抑制现象。现有的核酸纯化商品试剂盒有助于克服PCR的抑制现象。
• 培养：各种临床标本中均可分离出此病原体，但存在困难。支原体极不稳定，应该使用适当的运送培养基。采样推荐使用涤纶或聚酯拭子，避免使用棉签。可在SP4葡萄糖肉汤或琼脂中复苏，需生长21天或更长时间。转种可促进生长，普遍认为用于确诊不敏感。
• 血清学实验：与补体结合实验（complement fixation,CF）和免疫荧光抗体法（immunofluorescent antibody,IFA）相比，酶标法（enzyme immunoassays,EIAs）更为敏感和特异；血清抗体滴度增加4倍以上更具临床意义。但单份血清样品IgM抗体检测可能有助于诊断。不推荐冷凝集试验用于肺炎支原体感染的诊断。
  

四、分离鉴定

对人类致病的支原体的生长需要血清、生长因子（如酵母提取物）和代谢底物。SP4肉汤和琼脂（PH7.5）是最好的培养基，可用于培养肺炎支原体。肉汤应在空气条件下37℃孵育，琼脂平板在5%～10%二氧化碳气体环境中或95%氮气加上5%二氧化碳厌氧环境中生长最佳。如果无专用培养箱，烛缸或有GasPak催化剂的厌氧罐也可用于支原体培养。

肺炎支原体有非常小的球形菌落，可呈或不呈油煎蛋样。当不确定琼脂平板上是否有支原体菌落时，将亚甲蓝染液直接滴在平板上有助于判断，支原体菌落可被染成蓝色。肺炎支原体生长缓慢，分解糖，培养5～20天后在SP4培养基上呈球形菌落，在有豚鼠红细胞培养基上表现为溶血活性和红细胞吸附现象。

五、血清学检测

长期以来，血清学方法一直是诊断肺炎支原体所致呼吸道感染最常用的实验室检测方法。尽管培养和PCR方法也可用于呼吸道标本肺炎支原体检测，但由于急性感染后病原体在体内滞留时间长短不一，如没有其他的确证实验，如血清转化试验，很难评价其阳性结果的意义。

肺炎支原体含有脂质和蛋白抗原，能诱导感染者的抗体应答。约感染一周后即可检出，3～6周达高峰，之后逐渐下降。可基于不同的抗原和技术，通过几种不同的血清学方法进行检测。当支原体感染性疾病发生率高时，血清学是一种非常有用的流行病学工具，但不太适用于单个患者的及时检测。主要缺点是需要在急性期和恢复期，间隔2～3周采集双份血清，同时检测IgM和IgG以证实血清转变。此方法对40岁以上成人尤为重要，因为这些人可能由于再感染致IgM抗体达不到峰值。而且，IgM有时可存在数周至数月，仅凭IgM检测难以判断急性感染。有时抗体产生延迟，免疫抑制患者甚至不产生抗体。过早采集血清可能出现IgM假阴性结果。由于肺炎支原体是黏膜致病抗原，IgA是感染早期产生的抗体，可以很快升高和降低，因此它可能是急性感染较好的诊断指标，但很少有商业化的试剂盒包含IgA检测。

补体结合试验曾是肺炎支原体主要的血清学检测方法，主要检测早期IgM应答，但不能区分抗体类型。现已知该试验与其他病原体尤其是生殖支原体存在交叉反应。由于其他无关病因所致的急性炎症也可诱导产生具有交叉反应的自身抗体，从而产生假阳性结果。大多数临床实验室已采用其他方法替代补体结合试验。

免疫荧光抗体法、直接和间接IgM捕获血凝法、颗粒凝集法（particle afflutination antibody assays,PAs）也用于检测肺炎支原体。免疫荧光法使用肺炎支原体抗原包被的荧光载玻片，分别检测IgM和IgG。免疫荧光法操作简便，但结果解释带有主观性，需要荧光显微镜，同时肺炎支原体特异性IgG抗体的存在可能干扰IgM结果。定性和半定量PAs通过乳胶颗粒或明胶同时检测IgM和IgG，操作简便，但不比酶标法更有优势。PAs操作简易，已在一些国家普遍使用，但并非美国广泛使用的肺炎支原体感染血清学诊断方法。

酶标法出现于20世纪70年代，已成为美国最常用的肺炎支原体抗体检测方法。根据临床实验室修正法案（the Clinical Laboratory Improvement Amendment,CLIA），该方法列为中等或高度复杂性，可以是定性或定量试验，有些需要特殊的仪器设备。酶标法比补体结合试验或培养法更敏感，且检测所需的血清量非常少。因此法需要采集急性期和恢复期血清，限制了它在快速床旁诊断方面的应用。Meridian生物科技公司开发的免疫金卡（Immuno Card）基于膜的IgM特异性EIA方法，可用单份血清样本快速检测急性肺炎支原体感染。但在一项研究中发现，用这种酶标法分析肺炎患儿的阳性血清时，单份血清敏感度只有31.8%，双份血清敏感度可达88%。Thermo Fisher公司开发的Remel酶标法是另一种快速床旁定性血清学检测方法，可以同时检测IgM和IgG，不需要仪器，结果易读，敏感度、特异性与酶标法、免疫荧光法和补体结合法一样好。荷兰科学家将PCR作为参考方法综合评价了12种商业化酶标法和PAs试剂，他们发现大多数检测方法都存在敏感度或特异性方面的问题，提示它们在急性感染诊断中存在局限性，同时也重申了成人双份血清IgM和IgG抗体检测的必要性。他们的研究表明，PCR是一种更好的诊断方法。另有一项研究在很多健康献血者血清中检出肺炎支原体抗体，提示某些商业化酶标法试剂的抗原存在交叉反应，可能导致过度诊断支原体感染。针对不同患者，最好的商业化酶标法试剂的选择取决于患者年龄、采血时间、双份血清获取的难易程度、仪器设备以及实验人员的经验。但是，一个实验室同时开展多种检测方法并不经济实用。IgM或IgA血清学检测结合PCR方法可能是最适宜的诊断方法，但可能对IgM达不到峰值的成人患者用处较小，而且显著增加实验室检测成本。与肺炎支原体感染有关的冷凝集素（O型Rh阴性红细胞在4℃发生的凝集检测），仅出现约50%的患者中。滴度达64或128，或滴度呈4倍以上增长，提示近期有肺炎支原体感染，但该试验不特异。因此不推荐用冷凝集素的检测结果诊断肺炎支原体抗体感染。

六、肺炎支原体治疗

一般认为肺炎支原体对喹诺酮类、四环素类及大环内酯类敏感，所以不推荐对以上抗菌药物进行敏感度试验，除非体外评价新型及之前未检测过的药物。然而，日本、中国、欧洲和美国的研究表明，急性呼吸道感染儿童和成人23S rRNA基因的V区突变不断增加，使肺炎支原体对大环内酯类呈现高水平耐药，这一耐药现象在中国尤为突出，耐药率高达90%以上。高水平耐药具有重要的临床意义，有时迫使临床医生选择喹诺酮类等进行替代治疗。分子生物学技术可通过PCR方法直接检测临床样本rRNA的突变（无须分离肺炎支原体，有助于监测耐药趋势并提供快速诊断信息）。

七、小结

肺炎支原体培养，既耗时又极不敏感，但是呼吸道标本肺炎支原体分离培养在大多数情况下是有临床意义的，其结果的解释应结合呼吸道临床表现，因为存在少数无症状携带者。上呼吸道可能存在正常菌群，疑似支原体感染的呼吸道或无菌部位标本需通过培养鉴定到种。通过参考实验室，采用PCR方法或其他分子诊断技术检测肺炎支原体越来越普遍，但是阳性结果仍须结合临床情况综合考虑。急性期与恢复期抗体效价呈4倍增长对急性感染具有诊断意义。儿童、青少年和中青年采用适当的免疫球蛋白种特异性试剂盒单次检测为IgM阳性时，有时可诊断为急性感染，但并非总是，因为有可能存在IgM长期升高的病例。大多数情况下，经验治疗对肺炎支原体引起的轻微呼吸道感染有效，无须开展昂贵且耗时的微生物学检测。然而，具有临床意义的大环内酯类耐药性的出现可能会影响经验性抗菌药物的选择。

参考文献：

1.《临床微生物学手册》第11版.

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图文：王小虾