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专家笔记
内容分类: |
多耐与微生物 |
会议类别: |
市级 |
举办日期: |
2023年 |
专家名称: |
倪语星 |
会议名称: |
其他会议 |
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本帖最后由 高山雪莲W 于 2024-9-27 15:40 编辑
讲者丨倪语星(上海交通大学医学院附属瑞金医院)
整理丨薛彩霞(青岛市黄岛区中心医院
审核丨秦海燕
来源丨上海市级医院院感防控技能培训基地
随着微生物检验技术不断地出现,越来越多的检验技术应用于临床。来自上海交通大学医学院附属瑞金医院倪语星教授讲述的是细菌培养鉴定技术中新的快速检测技术,包括一些新的检测仪器的使用,可以给微生物检验提供一些帮助,快速获得检测结果,为临床医生精准诊断及治疗提供依据。细菌快速检验技术有很多,下面以血培养为例介绍标本送到实验室整个检验的流程,主要包括基于培养生长的微生物检验进展和基于非培养的快速检测技术。
一、微生物检验技术分类
(一)传统的检测技术
- 直接涂片染色镜检,具有快速、成本低的特点,但敏感性低,依赖经验,主观性强;
- 培养+药敏/鉴定具有金标准、特异性高、成本低的特点,但耗时长、敏感性低;细菌的生长需要时间。传统的微生物检测技术延续了几百年,对于危及生命的感染,会觉得比较慢。
(二)非培养技术中新的快速检测技术- 免疫学检测机器操作相对简单、成本低,但敏感性低,存在窗口期;
- 核酸分子检测具有快速、操作便捷、高灵敏性、高特异性但涉及PCR实验室及人员资质。
(三)培养技术中的新的快速培养技术
以败血症的病人为例,传统的培养方法是抽需氧+厌氧各两管,如果培养报阳性(第一个24小时),说明有细菌生长,需要做分离培养(第二个24小时),最后做鉴定+药敏(第三个24小时),药敏是细菌对抗菌药物的敏感性,培养+分离+鉴定+药敏过程至少需要72小时。新的快速检测技术是快速报阳做快速鉴定,可以直接做药敏。检验时间可以在第一个24小时或第二个24小时发报告,接到标本后的第一天或者第二天出报告。检测时间可以大大缩短,对临床治疗起到了很大的帮助作用。
二、微生物检验仪器设备
(一)全自动血培养仪全自动血培养仪解决了实验室夜间及节假日无人值班的问题、实验的时效性问题。血培养瓶会自动扫码、自动传输、阴性瓶会自动扔掉,阳性瓶会通知实验室相关人员拿走,又叫做自动售货机,其优点如下。
- 全封闭:全封闭环境提供稳定的光温条件,更利于病原体生长,信号表达稳定,检测灵敏度提高,降低假阳性。
- 全自动上下瓶:履带传送,机械臂抓取,阴阳性血瓶智能分类管理,自动上载/卸载。
- 革新算法:最先进的判读算法RAUC、R2R、EI三大法则相辅相成,大幅缩短报阳时间,最大化杜绝假阴性。
- 单瓶血量实时监测:每个血瓶进入仪器内部都需要“安检”,光学系统精准测量每个血瓶采血量。
- 超强数据传输与统计能力:配合MYLA有无限数据储存能力,结果实时自动发送Lis,自动统计分析质控指标,用数据指导持续改进。
- 无障碍人机对话:全中文操作界面,引导式操作系統,即使无经验人员也可以根据提示完成80%以上的警报及故障解决。
(二)全自动血培养工作站
有了自动售货机,在临床和急诊设置血培养工作站,采集的血培养瓶扫码放入,不需要人来管理,起到自动上瓶,自动下瓶的作用。特别适合病房分散,在每个病房大楼设置卫星血培养工作站,可以减少TAT时间,减少工作人员数量,解决夜间血培养送检问题。其优点如下:
- 标本接收条码化,容器标准化;
- 随到随做,24小时待机;
- 全自动血培养仪可以通过中间件连接,在每个病房大楼以及急诊化验间实现卫星血培养工作站,实现自动化标准化上机;
- 24小时实时与中心微生物室通联,对血瓶来源、阳情况等实时进行监控;
- 解放检验人员,集中精力关注阳性标本。
(三)卫星式血培养设备
在急诊/ICU实行卫星式血培养,有效缩短TAT。如急诊检验采用远程控制,界面的BACTEC FX立即孵育,减少周转时间。卫星血培养的优点:
- 改善实验室效能,弥补微生物实验室夜班不开放,自动培养只要把培养瓶放到机器上就行,能够缩短培养时间,优化培养流程,采血至送检时间缩短达82%;
- 优化诊疗流程,解决延迟上瓶而导致的阳性率低问题,住院天数缩短提高床位周转率。
- 快速出结果能够改善治疗方案,报阳平均时间减少10.1小时(P<0.001)首次调整抗生素时间平均减少17.2小时。
(四)自动接种+智能孵箱
自动化接种+智能化孵箱,用轨道连接起来,微生物检验就变成全自动流水线。全自动接种后由轨道送到智能化孵箱,由计算机判断细菌生长情况,根据细菌生长情况和它的图像传送到电脑进行判别。利用电脑下拉式的菜单来处理以上数据。只要点一下,就可以进行鉴定和药敏,处理快捷又准确,节约人力资源。
(五)自动鉴定与药敏分析仪
自动化检测方法操作简单省力,比手工法更快速地提供药敏 (MIC)结果,可通过计算机智能专家系统,对药敏结果进行分析判断。判断药敏试验结果,MIC值很重要,需要完整的MIC。判断标准叫做折点,折点经常变化,尤其是细菌耐药越来越严重的情况下,折点变化了,药敏卡片不能及时同步。快速药敏试验和结果报告在临床治疗方面具有重要价值。最大缺点是抗菌药物不能任意选择。
自动化仪器的优点与不足:
- 优点:①药物预先稀释包被;②操作简便,培养条件优化,速度加快;③结果自动判读,自动审核,自动打印;④专家系统分析耐药机制。
- 不足:①更新不及时;②MIC不完整,折点经常变化,特别是耐药菌;③药物不全,不能任意加减。
(六)中国定制药敏卡
这是根据中国医院专门设计并研发的,有以下优点:
- 临床与耐药监测网要求的药物(新、全),满足临床需要;
- 向临床提供快速药敏报告,缩短TAT;减少药敏试验时间,最大程度地减少补充药敏纸片,节省人力物力;
- 向临床提供完整的MIC值结果,更符合PK-PD要求,帮助临床选择更合适的药物与剂量;更适用于重症患者;更符合CLSL要求。
- 药物选用最新的配方,性能更好:更广泛的MIC检测范围,卡片设计更合理。
(七)CPO专用药敏板- 可确认被检测菌株碳青霉烯酶是否为“阳性”;
- 可实现肠杆菌科、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等碳霉烯酶的Ambler分类 (A/B/D);
- 可进行头孢他啶/阿维巴坦的药敏检测;
- 该药敏检测板可以实现革兰阴性菌20多种抗生素的药敏检测如替加环素,粘菌素、磷霉素等。
(八)显色培养基
显色培养基是鉴定(ID)+药敏(AST)一步完成,MRSA仅凭菌落生长和颜色即可鉴别,可用于耐药菌(MRSA)的主动筛查。
- 显色培养基的优点:①操作简便,缩短检验周期;②仅适用部分耐药机制的检测;③可用于耐药菌主动筛查。
- 显色培养基的不足:价格昂贵,进口产品,国内尚未获批。
三、微生物鉴定进入质谱时代
(一)飞行时间质量分析器(TOF):离子在电场作用下,加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测,离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间平方成正比,从而对样品进行分析。
(二)基质辅助激光解析电离离子源(MALDI):激光照射样品与基质形成共结晶薄膜,激光照射晶体后,基质分子吸收能量与样品解吸附并使其电离。过去需要24小时,现在需要很短的时间。
(三)MS+靶标微滴生长方法(CMI)研究开发了一种基于MALDI-TOF MS系统药敏检测的表型方法,直接靶板微滴生长实验,在有或无美罗培南的营养肉汤中培养,敏感性和特异性100%(4小时培养/6µl),适合肺炎克雷伯菌对碳青霉烯酶敏感性检测的准确性。MS法药敏试验优点与不足:①开拓了MS法药敏试验;②类似微量稀释法,可获得MIC结果;③目前仅在研究阶段,质谱(MS)方面有拓展研究:如检测耐药酶、检测水解峰谱、检测耐药基因、PCR核酸质谱等。
四、非培养快速检测技术
基于非培养的快速检测技术,从单细胞到蛋白、分子,科研不断创新,引进新技术,改变检验流程,缩短TAT。
(一)细胞水平的技术方法FORMULA个体细胞计数快速药敏分析仪以微量肉汤稀释法为基础,遵循当前常用的药敏解释标准EUCAST和CLSL标准,对临床使用习惯兼容性高,联合MALDI-TOF MS使用可以实现2小时内完成快速鉴定+药敏临床报告,在药敏检测方面具有更好地应用前景。
- 个体细胞计数法药敏试验优点与不足(1)检测方法不变:基于细胞生长或抑制,以微量肉汤稀释法为基础;(2)判断标准不变:遵循当前EUCAST和CLSI的药敏解释标准;(3)用电阻抗法进行单个细胞计数,不需出现肉眼可见的浊度变化(4)2小时内完成药敏试验;不足之处是需要个体细胞计数快速药敏分析仪。
- 细胞水平是新兴的方法即单细胞拉曼光谱技术,拉曼光谱被认为是细胞的“ 分子指纹图谱”,可对细胞的表型特征进行识别和分析,有望成为下一代表型分析工具。单细胞拉曼光谱技术 (Single-Ce11 RamanSpectra, SCRS) 采用单色激光,结合共聚焦显微技术从而实现检测单个细菌细胞,无需将细胞培养增殖至宏观检测水平,可以真实地反映细菌细胞在原位状态下的活性与功能,适合于对微生物进行分析,需要特殊仪器设备。
(二)蛋白水平的技术方法
1.倾向免疫层流即胶体金检测技术:新冠抗原检测属于此技术。倾向免疫层流的优点:
(1)一卡可检测5种常见的CRE酶型;
(2)分析酶型:KPC, NDM, IMP, VIM, OXA-48;
(3)不需设备,操作简便,15分钟出结果;
(4)通过FDA认证和国内二类上市许可。
不足之处是价格和收费标准有待商榷。
2.真菌血清学检测方法,属于抗原抗体检测的范畴。2022年《侵袭性真菌病实验室诊断方法临床应用专家共识》,血清学检测方法已临床应用,血清学抗原检查适用于IFD的早期诊断,耗时短,快速的结果报告,是传统真菌学检查有益的补充。
(1)真菌血清学抗原检测:
①真菌1,3-β-D葡聚糖检测(G试验):G实验可用于怀疑IFD患者(包括念珠菌病、曲霉病、肺孢子菌病等,不包括隐球菌病、毛霉病)。阴性结果排除真菌感染的意义更大。推荐动态连续监测,可每周检测1-2次。
②曲霉菌半乳甘露聚糖检测(GM试验)适用于怀疑IA的患者,检查血清或BALF。阳性结果是IA临床诊断证据之一,需要结合临床表现、其他真菌学检查以及影像学进行综合判断。
③隐球菌抗原检测(GXM),GXM抗原检测用于诊断隐球菌病,脑脊液或血清抗原阳性是隐球菌病的确诊证据。
(2)真菌血清学抗体检测(IgG, IgE):抗体检测适用于无明显免疫抑制人群。慢性空洞性肺曲霉病可检测曲霉特异性IgG抗体,变应性支气管肺曲霉病患者可检测曲霉特异性IgE抗体。
(3)G实验的临床意义和判断标准
①诊断侵袭性念珠菌病IC,国内外指南推荐:G实验在诊断侵袭性念珠菌病时采用单一阈值,且推荐连续做2次,每次>80pg/ml。
②诊断耶氏肺孢子菌(PJP):G实验对于检测PJP也有很大价值,在排除其他侵袭性真菌的情况下,2次或以上的血清>80pg/ml,可以考虑PJP,但阴性排除PJP的价值高于阳性诊断PJP的价值。
(4)隐球菌荚膜多糖抗原检测(GXM):2019年EORTC/MSG侵袭性真菌病指南
①脑脊液或血液中的CrAg阳性作为隐球菌感染的诊断依据。隐性感染者,早期无任何临床症状和影像学改变,仅表现为血液隐球菌荚膜多糖抗原阳性。
②研究显示,血清中的隐球菌荚膜多糖抗原可以早于临床症状3周检测到。
③胶体金法灵敏度优于其他隐球菌抗原检测方法。
(5)真菌血清学检查的特点
①GXM检测:用于诊断隐球菌病,脑脊液或血液抗原(GXM)阳性是隐球菌病的确诊证据。
②GM实验:适用于怀疑IA的患者,血清GM阳性是粒缺IA临床诊断证据之一,非粒缺患者推荐 BALF-GM,须注意判断阈值,影响因素,结合临床表现,其他真菌学检查以及影像学表现综合判断。
③G实验:可用于怀疑IFD(包括念珠菌、曲霉、肺孢子菌等,但不包括隐球菌、毛霉)的患者,须注意判断阈值,影响因素,阴性结果除外真菌感染的意义更大。
④抗体检测:适用于无明显免疫抑制人群,慢性空洞性肺曲霉病科检测曲霉IgG抗体,过敏性支气管肺曲霉病患者可检测曲霉IgE。推荐:动态检测,组合检测(培养+非培养),结合临床病史、症状体征及影像学检查,有助于早期诊断侵袭性真菌病。
(三)分子水平的技术方法
1.巢式多重PCR(Film Array BCID Panel)血流感染测试:1个测试卡能检测出24种病原体靶标、3种耐药基因,只需1小时。检测出的病原菌有革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、真菌等。革兰阳性细菌包括肠球菌、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、化脓链球菌等;革兰阴性细菌包括鲍曼不动杯菌、肠杆菌科细菌、 流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌等;真菌包括白假丝酵母、光滑假丝酵母、克柔假丝酵母、近平滑假丝酵母、热带假丝酵母等。
2.荧光定量PCR(Xpert,Carba-R)
(1)荧光定量PCR(Xpert,Carba-R),100株CRE分离株中,有73例检测到碳青霉烯酶基因。Xpert对应的灵敏度及特异度分别为94.5%和100.0%,检测时长仅47分钟,是结果最快的检测方法。其中IMP+VIM、KPC、KPC+IMP、NDM碳青霉烯基因的检测灵敏度与特异度均为100%。IP碳青霉烯基因检测的灵敏度为79%,是由于4例IMP-8碳青霉烯酶基因未包含在靶标基因中而末被检测。MHT、mCIM检测都需过夜孵育而耗时过长,Carba-NP和MHA虽只要3h却须繁琐的试剂配制与操作培训,综合所述,与其他几种表型方法相比,Xpert检测准确、快速,此外还可报告具体碳青霉烯酶基因信息,1小时内检出CRE,灵敏度94.5%,特异度100%。
(2)分子诊断平台:微流控恒温扩增芯片法检测流程:病原菌DNA提取时间约1小时,样本DNA+恒温扩增试剂,加样后离心入仓,恒温扩增检测,实时检测结果,打印检验报告。
3.宏基因组测序mNGS和tNGS,mNGS为病原体诊断打开了一扇窗户,掌握新前沿技术,了解它的优势和缺点,对检测结果要小心求证。检测流程是采集感染部位样本→提取核酸→高通量测序→生物信息分析→检测结果→报告解读。
(1)分子水平:全血靶向检测病原+耐药(BALF、肛拭),检测比较全面,可一次性检测5种常见病原微生物和导致细菌耐药相关的9项耐药基因,5种病原菌分别是大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌。9种耐药基因分别是KPC、CTXM、mecA、NDM、IMP、VIM、OXA、VanA、VanB。
(2)宏基因组测序关注的耐药基因MARKER(CLSL):金黄色葡萄球菌耐药机制是mecA/PBP2a. SCCmec,AST表型是头孢西丁;肠球菌的耐药机制是vanA. vanB,AST表型是万古霉素;肠杆菌科细菌耐药机制是ESBL(CTX-M,TEM,SHV)KPC,OXA-48-like, IPM, VIM,NDM,AST表型是头孢菌素类和碳青霉烯类。
4.分子药敏优点与不足
优点:
(1)发展迅速,耐药基因检测产品不断涌现;
(2)GeneXpert MTB/RIF-R TB检测MDR-TB;
(3)Xpert Carba-R 检测碳青霉烯耐药基因;
(4)Filmarray的血流感染试剂包含了11种常见的耐药基因。
不足:有耐药基因不一定表达,耐药基因必须与病原菌一一对应,在宿主体内才能发挥作用。如果检测到耐药基因,没有检测到细菌,是没有用的。因为耐药基因不会单独发挥作用,只有在病原菌体内才能发挥作用。
小 结
微生物新技术体现在快速检测(单细胞,蛋白,分子)水平,缩短TAT;疾病诊断,查病因,查细菌、病毒、真菌等,采取组合检验;全自动流水线具备数字化、信息化、智能化、可视化等优势;基因检测有专家系统支持可溯源。微生物专家应走出实验室,走向临床,参与感控和AMS,MDT;利用无线移动工具,查看电子病历,利用监测数据、数据库、生物样本库、菌种库等资源进行分析与管理,将全院信息整合综合判断,更好地为临床服务。理想的微生物检验是报告及时、有结果解释和用药推荐;技术和信息革命带来流程改善,标准化、规范化、信息化、高效地服务临床已成为必然趋势。
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