【感染科普笔记2023-9-28】探秘病原微生物专栏丨厌氧培养，难么？

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作者：梁悦怡/温海楠（承德医学院附属医院）

审核：宁永忠（北京垂杨柳医院）/蓝雪0816



虽然厌氧菌引起的临床感染并不少见，但能够进行厌氧培养的实验室却不多。原因何在？这与厌氧菌培养条件苛刻有直接关系。但是，厌氧培养的难度到底有多大？知己知彼，百战不殆，我们先了解厌氧菌培养流程吧。

一、了解厌氧菌

厌氧菌是指那些在无氧条件下或在氧化还原电势极低（-0.2V以下）的条件下才能生长（或在此条件下比在含氧的大气中生长得好）的细菌，属于人体正常菌群的一部分，可定植在机体的多个部位，如上呼吸道、肠道、女性生殖道以及毛囊等。按照是否形成芽孢、染色特性以及镜下形态厌氧菌可以分成两类，一类是有芽孢的革兰阳性杆菌，主要为梭菌属，如破伤风梭菌，产气荚膜梭菌和艰难梭菌等；另一类是无芽孢的革兰阳性、革兰阴性菌，主要有消化链球菌属、拟杆菌属、普雷沃菌属、梭杆菌属等。厌氧菌可引起人体不同部位的感染，尤其当人体深部组织受到创伤时，更有利于厌氧菌的繁殖，引起内源性或外源性感染，致使患者的病情进一步恶化，严重者可引起血流感染，导致脓毒症休克或患者死亡。

二、走进厌氧菌培养

厌氧培养法有疱肉培养基法、厌氧手套箱法、厌氧罐法、厌氧气袋法等。

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  疱肉培养基（图1a）是将疱肉和肉汤装入大试管，液面封凡士林，造成试管内无氧环境。厌氧罐（图1b）是普通的干燥缸，用物理化学方法使缸内造成厌氧环境，以利于专性厌氧菌生长。
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  厌氧手套箱（图1c）则是一个密闭的箱体，箱前面有一个有机玻璃做的透明面板，板上装有两个手套，可通过手套在箱内进行操作。厌氧手套箱是公认的培养厌氧菌的最佳仪器之一，这种厌氧箱适于培养基还原、厌氧菌标本接种、分离培养、生化鉴定和体外药敏试验等厌氧菌培养的全套操作，但操作繁琐、价格比较昂贵限制了厌氧手套箱的普及。
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  厌氧气袋法是在无毒、透明不透气的塑料袋放入厌氧产气袋和厌氧指示剂（图2），造成袋内无氧环境培养厌氧菌。厌氧袋法由于价格低廉、操作便捷目前应用较广，对脆弱拟杆菌（图3）、艰难梭菌（图4）、产气荚膜梭菌等厌氧菌均可培养出来。
  

当厌氧培养标本送至实验室后，应尽快接种（接种前记得先将厌氧板放入厌氧环境中预还原还原），最好在30min内完成接种，长时间暴露于空气中会导致大部分厌氧菌死亡，必要时进行床旁接种。在厌氧装置内装入厌氧产气袋和厌氧指示剂，放入已接种标本或细菌的平板即可。厌氧指示剂无色表示袋内已达无氧状态，将厌氧装备放入35℃培养箱内孵育48h后，才可以观察菌落生长情况，选择可疑菌落进行鉴定，这样可以避免某些慢生长的厌氧菌在对数生长期暴露于空气而过早死亡。不过，引起气性坏疽的产气荚膜梭菌生长非常迅速，过夜培养后即可鉴定。

三、厌氧菌不仅培养难，还有难鉴定！

当我们进行厌氧培养标本接种时需同时接种血琼脂培养基和厌氧培养基，分别置于需氧和厌氧环境（将厌氧培养基放入厌氧袋中）中培养，35℃培养箱培养48h后观察厌氧环境中的厌氧培养基和需氧环境中的血琼脂培养基上菌落生长情况。若厌氧培养基和血琼脂培养基均有细菌生长，观察其菌落特征是否为同一种细菌。若相同，则可能不是厌氧菌，但仍需对厌氧培养基和血琼脂培养基上的菌落进行诸如涂片革兰染色、镜检等操作，进一步确认。如厌氧培养基有菌生长，而血琼脂培养基没有，则挑取可疑菌落涂片，初步确定是革兰阴性菌还是阳性菌，并进行耐氧试验。从原始平板挑取菌落进行耐氧试验时，原始平板需继续培养，防止某些生长缓慢的厌氧菌被漏掉。耐氧试验阳性的细菌则被认为是厌氧菌，可以使用VITEK系统的厌氧菌鉴定卡（ANC ID card）等方式进一步鉴定。有质谱仪的实验室可以使用MALDI-TOF MS直接对可疑菌落进行鉴定。有一些肠杆菌目、链球菌等在厌氧环境中较普通的需氧环境中生长的更好，因此观察平板时要引起足够重视。

这么一看，厌氧培养其实并不难，准备好厌氧装备加上厌氧培养基，合格的标本就OK啦！操作和所用耗材都没有想象中那么难，如果想在自己的实验室开展厌氧菌培养，就一起把厌氧培养技术操练起来吧！


注：耐氧试验是指将在厌氧培养基上生长的同一个单个菌落分别接种到厌氧培养基（立刻放到厌氧环境中培养）和两块普通血琼脂培养基上（分别放在大气和5%CO2环境中培养），菌落较小时应先接种厌氧培养基，以保证厌氧菌的存活。24~48h比较待检菌在培养基上的生长状况（表1）。为确保耐氧试验的准确性，应重复耐氧试验2~3次。
表1 耐氧试验结果判读

注：-，不生长；±，生长弱。a从厌氧培养基上转种时不会出现这种情况；b微需氧培养时生长良好。


图1 a疱肉培养基b 厌氧罐；c氧氧手套箱（图源网络）


图2 厌氧气袋


图3 脆弱拟杆菌（厌氧培养48h）


图4 艰难梭菌（厌氧培养48h）
参考文献：[1] De Keukeleire S, Wybo I, Naessens A, Echahidi F, Van der Beken M, Vandoorslaer K, Vermeulen S, Piérard D. Anaerobic bacteraemia: a 10-year retrospective epidemiological survey. Anaerobe. 2016 Jun;39:54-9.[2] 王辉等，临床微生物学手册（Manual of Clinical Microbiology,12th）.

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图文：王小虾

林_ARa7z

学习了 谢谢老师

林_ARa7z

厌氧培养不难，主要是成本高！

jcyyhlb

老师辛苦了，谢谢老师的分享学习了。

wuxing718

尽快接种有困难

高山雪莲W

厌氧菌不仅培养难，还有难鉴定
学习了，谢谢分享！

周琳珍

学习了 谢谢老师

kr1l6

厌氧菌不仅培养难，还有难鉴定！

duweili

感谢老师分享！厌氧菌又进一步了解

LJMX0211

谢谢老师分享，学习了

LJMX0211

谢谢老师分享，涨知识啦