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一枝梅

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一枝梅

生物感染的病原学检查法
文 / 张力平
微生物感染的病原学检查可查明标本中的病原微生物并对其进行种属鉴定，必要时进行药物敏感试验和毒力检查等，从而协助医生对感染性疾病进行病因学诊断、指导合理用药或观察治疗效果。
微生物感染的病原学实验室诊断方法大致包括：①光学显微镜对标本或组织中的病原体的形态学检查；②病原体的分离培养和鉴定；③用免疫学技术对病原体抗原或相应抗体的检测；④用分子生物学方法对病原体特异性基因的检测。
标本的采集与送检 微生物学检查的第一步，方法的正确与否直接影响病原体的检出率，因此应注意下述原则：
1．采集标本时应无菌操作，尽量避免污染；盛放标本的容器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签。
2．应选择感染部位或病变明显的部位采集标本，避免周围组织、器官或分泌物中的杂菌污染。例如感染性伤口，应从其深部而不是从表面采集标本；若采集龈沟液检查口腔厌氧菌，应将无菌滤纸条深入龈沟中，停留数秒后取出；怀疑细菌性痢疾时，应采集有粘液或脓血的粪便；采集病毒的标本应尽量含有感染的细胞。
3．根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出部位选择在最佳时间采集适宜标本。例如，可疑伤寒的病人，在病程的1～2周内取血液，2～3周时则取粪便或尿液送检；怀疑流行性脑膜炎的病人，应选取脑脊液、血液或皮肤上的出血淤斑进行检测；如果进行病毒培养或其抗原检测，一般应取急性期标本，标本采集越早，病毒的阳性检出率越高。
4．对于怀疑细菌感染的标本，尽量在抗生素使用前采集，特别是对抗生素敏感的病原体，如乙型溶血性链球菌、脑膜炎奈瑟菌。病毒对抗生素不敏感，故无此限制。而且用于病毒分离培养的标本应加入抗生素，以避免在病毒培养过程中的细菌污染。
5．检查病原体的特异性抗体IgG时，应采集急性期和恢复期双份血清，只有当恢复期血清抗体效价比急性期的效价明显升高达4倍或以上时，方有诊断价值。检测血清特异性抗体的标本应保存在-20℃。
6．标本采集后应及时送检。大多数细菌标本应冷藏送检，但是某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感，应注意保温，尽量床旁接种，并预温相应的培养基。病毒在室温中易于灭活，应立即接种；如需运送，以4℃为宜；若需保存较长时间，加入适当的保护剂如甘油或二甲基亚砜后，放入-70℃保存。
第一节 细菌感染的微生物学检查法
医生根据临床上诊断和治疗的需要选择不同的标本和检查方法进行实验室诊断，从而鉴定出感染的病原菌。实验室诊断包括细菌学诊断，即检测及鉴定病原菌；检测病原菌成分（抗原和核酸）以及检测患者血清中特异性抗体（图8-1）。
图8-1 细菌感染的实验诊断方法
一、细菌学诊断
形态学检查 光镜下可观察直接涂片或分离培养的细菌形态（包括染色标本和不染色标本），直接涂片染色只对特定样品中的细菌有诊断价值。如在患者脓性脑脊液或淤血点中的白细胞内检出革兰染色阴性的双球菌即可诊断为流行性脑膜炎；在生殖器官病变部位的标本中发现革兰染色阴性的双球菌，结合临床症状即可初步诊断为淋病奈瑟菌感染。但很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征，仅凭形态学不能做确切的诊断，需经细菌的分离培养，甚至纯培养后，对细菌进行生化和血清学鉴定，方能明确感染的细菌。
不染色标本主要用于检查细菌的动力，如在镜下观察标本有无“鱼群”样排列、运动活泼的细菌，可对霍乱弧菌进行初步诊断。
1．细菌染色检查法 主要包括革兰染色、抗酸染色和荧光染色后光镜检查。
（1）革兰染色法（Gram stain）：是在1884年由革兰（Hans Christian Gram）发明的，它一直是对细菌进行分类鉴别的最常用染色方法。
（2）抗酸染色法（acid-fast stain）：是鉴定结核和麻风等分枝杆菌属细菌的重要方法。细菌经涂片、干燥和固定后，先用5%石炭酸复红初染，细菌被染成红色，然后用3%盐酸酒精脱色，由于分枝杆菌细胞壁富含脂类物质，一旦着色，盐酸酒精难以将其脱色，故为抗酸染色阳性（红色）。而一般的细菌容易脱色，再经美兰复染呈现蓝色。若在痰液中检出抗酸染色阳性的杆状细菌，则可诊断患者有结核分枝杆菌的感染。
用金胺对结核杆菌进行染色，在荧光显微镜下可观察到呈金黄色荧光的菌体，此法可提高结核分枝杆菌的检出率。
另外，有一些特殊的染色方法可将细菌的特殊结构，如细菌的鞭毛、荚膜和芽胞进行染色。
2．暗视野检查（darkfield examination） 在普通光镜上配置特制的暗视野聚光器即成暗视野显微镜，其反光镜反射过来的光线不能进入镜筒，使背景视野变暗。而光线只能从暗视野聚光器周围边缘斜射到菌体上，由于散射作用而使菌体发光，反射到物镜映入眼中。因此在暗视野中可看到发亮的细菌。本方法易于观察不染色活菌，故常用于检查活菌、螺旋体及其动力。
病原菌的分离培养 原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌落后进行纯培养，从而对细菌做进一步的生物学、免疫学、致病性或细菌的药物敏感性等方面的检查，最终做出确切的报告。细菌培养时应选择适宜的培养基，以便提供特定细菌生长所需的必要条件，例如，培养基的成分和pH、培养的时间、温度等，应给厌氧菌提供一个厌氧环境。分离培养后根据菌落的大小、形态、颜色、表面性状、透明度和溶血性等对细菌做出初步的识别。同时取单个菌落再次进行革兰染色并镜下观察。另外，在液体培养基中细菌的沉淀、浑浊或表面生长状态以及在半固体培养基上是否检出细菌的动力，均为细菌的鉴定提供有用的信息。
生化试验 在得到细菌纯培养物后，用糖发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验等对细菌的酶系统和其代谢产物的检查，是鉴别细菌的重要方法之一。特别是有些细菌，例如肠道感染的细菌一般为革兰阴性菌，它们的染色性、镜下形态和菌落特征基本相同，因此有必要经细菌的分离培养后用生化试验进行鉴定。但其步骤繁杂耗时。随着现代化技术的发展，细菌检测的技术水平也不断地提高，正在逐步实现快速化、微量化、自动化和标准化。现在国内大医院已引进检测细菌生化反应的商品化试剂盒和多种微量、快速、半自动或全自动的细菌鉴定系统，一般24小时内即可完成从微量培养细菌、自动监测、记录到打印出结果的全过程，能准确鉴定出一般医院常见的致病菌，而且适用于难以培养细菌的鉴定以及药物敏感试验。
血清学鉴定 利用含已知的特异性抗体的免疫血清，如志贺菌属、沙门菌属的单价和多价诊断血清，检测未知细菌的抗原，不仅能对分离培养的细菌进行种的鉴定，还可以进一步对细菌进行群和型的鉴别。常用方法是玻片凝集试验。
动物实验 一般不作为临床标本的细菌学常规检查技术，但对测定细菌的毒力或致病性有重要意义，故可选敏感动物用于疑难的病原菌分离或微生物学的研究。常用于病原菌检查的动物有小鼠、豚鼠和家兔等。根据细菌致病性选择接种途径，有皮内、皮下、腹腔、静脉、脑内、鼻腔和灌胃等。现在，用家兔对细菌内毒素或热原质的检测已被鲎试验（limulus tests）替代。
毒力检测 细菌毒力依其侵袭力和产生毒素不同而强弱不一，可经灌胃、腹腔、静脉或皮下注射等途径在实验动物体内测定，一般以半数致死量（median lethal dose，LD50）或半数感染量（median infective dose，ID50）来表示，即在一定时间内，通过一定的途径，使一定体重的某种实验动物半数死亡或感染的最小毒素量或最少细菌数。也可在体外用Elek平板等方法检测细菌毒素，如白喉毒素或肠产毒性大肠埃希菌肠毒素的检测。
药物敏感试验（Antimicrobial susceptibility testing） 在已确定患者所感染的病原菌后，临床按常规用药又没有明显疗效的时候，有必要做药物敏感试验（简称药敏试验），在体外测定药物抑制或杀死细菌的能力，从而指导临床的正确有效地用药。特别是近年来随着抗菌药物的广泛使用，耐药菌株逐渐增多，在必要时进行药敏实验是十分重要的。其方法有纸碟法、试管法、小杯法和凹孔法等。其中纸碟法和试管法是常用的方法。前者依据药纸片周围是否出现抑菌圈及其大小，后者则凭借观察抑菌或杀菌药物浓度来判断细菌对某一药物的敏感或耐药程度。在药敏试验中，最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）是能够抑制培养基内细菌生长的最低药物浓度；最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）是指能够杀灭培养基内细菌的最低药物浓度。MIC和MBC的值越低，表示细菌对该药越敏感。杀菌性药物的抑菌和杀菌浓度相等或相近，但抑菌性药物即使在很高的浓度下也无杀菌作用。现在已有检测药物敏感试验的全自动仪器。
二、检测病原菌成分
抗原的检测 多种免疫学实验技术可用于细菌抗原的检测。其原理是用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分。常用的方法有玻片凝集试验、协同凝集试验、间接血凝试验、乳胶凝集试验、对流免疫试验、酶免疫技术、免疫荧光技术和同位素标记技术等。这些试验特异、敏感、简便，即使是在采集样品前患者使用了抗生素，对细菌的培养不易成功，但细菌的抗原仍能被检测出来。因此抗原的检测是检查病原菌的常用技术，可直接使用临床标本或在细菌分离培养后进行。
核酸的检测 传统的微生物学鉴定技术主要根据微生物形态学和生化等表型特征来进行。但有些试验耗时长、费用高或难以顺利完成。随着分子生物学技术的发展，多种检测病原菌核酸的实验技术已经被建立。这不但能有助于感染性疾病的确诊，还能确定病原菌的基因型，使微生物学的检测技术从细菌生物学检查进展到细菌分子生物学的鉴定。一般而言，分子生物学诊断技术常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体。目前常用的方法主要有核酸杂交（nucleotide hybridization）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）等（图8-2）。
图8-2 细菌感染的基因诊断技术
1．核酸杂交技术 核酸分子杂交是根据DNA双螺旋分子的碱基互补原理而设计的。将病原体特异的基因序列合成并标记作为探针，与待检标本中的核酸进行杂交，若待检标本中有与探针序列完全互补的核酸片段，根据碱基互补原则，探针和相对应的核酸片段互相结合，标记有化学发光物质、辣根过氧化物酶、地高辛或放射性物质的探针经不同的方法即可被检测出来，使标本中有无相应的病原体基因及其分子大小显示出来。
核酸杂交技术包括Southern印迹杂交（Southern blot）、Northern印迹杂交（Northern blot）、斑点杂交（dot blot）和原位杂交（in situ hybridization，ISH）等。Southern印迹杂交也称为DNA 印迹杂交，是确定特异DNA片段的方法。将经限制性内切酶消化的DNA在琼脂糖凝胶中电泳，并转移到固相支持物，如硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane，NC膜）或尼龙膜上，用同位素等方法标记的探针与之杂交，通过放射自显影或显色反应检出已与探针DNA杂交的区带。Northern印迹法又称为RNA 印迹杂交，原理与Southern相似，但用于检测RNA。原位杂交是将细胞或组织固定在玻片上，然后检查其中是否有与特异性探针相结合的目的基因。这种方法能进行定位诊断。
这些技术同时具备了碱基互补的高度特异性和标记技术的敏感性，其敏感性已经达到0.05pg/?l水平。由于它们具有快速、敏感、特异以及样本量少的优点，现已将此技术应用于诊断结核分枝杆菌、军团菌、幽门螺杆菌、空肠弯曲菌和致病性大肠埃希菌等致病菌。
2．PCR 是1985年首先由Kary Mullis建立的一种选择性DNA或RNA体外合成放大技术。其基本原理是根据细胞分裂中DNA半保留复制机理，在体外用一对寡聚DNA作为引物，通过加温—退火—DNA合成等几个步骤的重复多次循环，使目的DNA片段得到扩增。鉴于这种扩增产物是以指数形式积累的，经20～30个循环后，目的基因的扩增倍数可达106。经琼脂糖电泳，可显示出一条特定的DNA区带，与对照比较可做出鉴定。PCR技术整个循环过程需在特殊的DNA扩增仪进行，仅需要几个小时，因此具有快速、敏感、特异和简便的优点。
PCR经常在下列情况用于病原体的检查：①形态和生化反应不典型的病原微生物的鉴定；②解决混合标本问题：当病原菌与大量正常菌群成员混合在一起时，分离鉴定耗时费力，用PCR技术克服了上述问题，目前已用于肠道病原菌的快速诊断；③生长缓慢或难于培养的病原体鉴定：如幽门螺杆菌、分枝杆菌和病毒等；④难以鉴定的病原体诊断，如淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌、肝炎病毒、人乳头瘤病毒（HPV）等。脑膜炎奈瑟菌感染病情进展迅速，用细菌培养方法耗时且检出率低，用PCR技术可快速检出脑脊液中的特异DNA，因此PCR可作为流行性脑膜炎病原学的快速诊断方法。
但应注意的是，由于PCR技术的敏感性极高，极微量的污染即可造成非特异性扩增，容易出现假阳性结果。所以要严格操作，消除污染。现在已有实时PCR技术（real-time PCR）可以检测出病原微生物核酸的拷贝数，从而进行细菌定量。
三、抗体的检测
病原菌侵入机体后，其抗原性物质能刺激机体产生特异性抗体。存在于血液或其他体液中的特异性抗体，常随病程的进展发生变化。用已知细菌或其抗原检测病人体内是否产生了相应的特异性抗体及其量的多少，可作为某些病原菌感染的辅助诊断。因需采集病人的血清进行此类试验，故称之为血清学诊断（serological diagnosis）。常用的血清学试验包括：玻片或试管凝集试验、沉淀试验、补体结合试验和冷凝集试验等，可根据病原菌的种类加以选择。血清学诊断一般适用于病程较长和抗原性较强的病原菌引起的感染。
若以血清学试验结果作为诊断依据时，应在急性期和恢复期各取一份血清同时检测，恢复期血清效价明显升高4倍或以上时方有诊断价值。
用血清学试验检测特异性抗体对感染性疾病的诊断有两方面的局限：①在疾病的早期，抗体难以检测出来，因此难以作为早期诊断的依据；②当抗体水平升高时，很难找出抗体效价与病情之间的关系。
随着现代科学技术的发展，细菌的检测技术也不断提高，同位素技术、气相色谱技术和电阻抗技术等也已开始应用于细菌的检查和研究。
第二节 病毒感染的微生物学检查法
经典的病毒学检查方法包括病毒分离鉴定和血清学诊断（抗体的检测）。由于分子病毒学和免疫学的发展，近年来又建立了许多诊断方法，包括电镜直接观察形态、检查病毒抗原、核酸等，使得病毒感染的快速诊断成为可能（图8-3）。
图8-3 病毒感染的实验室诊断方法
一、形态学检查
电子显微镜（electromicroscopy，EM） 能观察病毒颗粒的形态和大小。对含有高浓度的病毒颗粒（≥107病毒/ml）的样品，可直接用电镜进行观察。对含量少的样品可用免疫电镜法（immunoelectromicroscopy，IEM）检查。即先将标本与特异性血清混合，使病毒颗粒凝聚，再进行电镜观察，可提高检出率，例如甲型肝炎病毒、轮状病毒感染的粪便标本、人类免疫缺陷病毒（HIV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染者的血清标本等均可采用此法查出典型形态的病毒颗粒。
光学显微镜 能观察病毒感染细胞内的病理变化，如包涵体或多核巨细胞等。有些病毒感染细胞后，在细胞浆或胞核内会出现用光学显微镜可观察到的圆形或椭圆形的斑块，称为包涵体（inclusion body）。在多数情况下，包涵体是由大量病毒在细胞内合成堆积而形成。包涵体的位置（胞浆内或核内）和经Giemsa染色表现的嗜酸性或嗜碱性的不同对某些病毒性疾病的诊断有重要意义。如狂犬病病毒感染后可在脑神经细胞浆中检出嗜酸性包涵体，称为内基小体（Negri body），可辅助诊断狂犬病（图35-3）。
二、病毒的分离培养的方法
病毒的分离用于：①有新的流行发生时，如流感；②不能应用血清学诊断时；③一种临床疾病可被多种病原体引起时，例如无菌性脑膜炎可被多种病毒引起；呼吸系统疾病综合征可被多种病毒、支原体或其他病原体感染引起。
病毒必须在敏感的活细胞内增殖，所以应使用易感的活细胞对病毒进行分离培养和鉴定。其方法包括动物接种、鸡胚培养和细胞培养。
动物接种 动物接种是最原始的分离病毒的方法，但是现在已经很少用于临床实验室。目前仍然使用的是小白鼠脑内接种对狂犬病病毒或乙型脑炎病毒的分离和鉴定。
鸡胚培养 不同日龄（9～14日）的鸡胚经不同的接种途径可用于不同病毒的培养。如绒毛尿囊膜接种常用于痘病毒和单纯疱疹病毒的培养，病毒繁殖后有痘斑的形成；卵黄囊用于某些嗜神经病毒及衣原体的培养；羊膜腔接种用于流感病毒初次分离培养；尿囊腔接种常用于流感病毒和腮腺炎病毒等的培养。收获尿囊液或羊水等做血凝试验可作为含血凝素病毒生长繁殖的指标。随着细胞培养技术的成熟和广泛应用，鸡胚接种已经少用，但仍然是培养流感病毒最敏感、特异的方法。
组织培养 包括三种类型：器官培养（organ culture）、组织培养（tissue culture）和细胞培养（cell culture）。细胞培养是病毒研究、检测以及疫苗制备的一个重要技术，在病毒学发展过程中发挥了相当重要的作用。用于病毒分离培养的细胞主要有原代细胞、二倍体细胞和传代细胞系。
1．原代细胞培养 原代细胞是由新鲜组织（动物、鸡胚或人胚组织）制备的单层细胞，对多种病毒的敏感性高。原代恒河猴肾细胞是培养肠道病毒、正粘病毒和副粘病毒等的常用细胞。但由于制备不方便，一般只能传2～3代，故逐渐少用。
2．二倍体细胞培养 在传代过程中保持二倍体性质（46条染色体），一般能传40～50代，例如人胚肺成纤维细胞。二倍体细胞可用于多种病毒的分离和疫苗的制备。
3．传代细胞培养 传代细胞是能在体外持续传代的单细胞，由突变的二倍体细胞传代或人及动物肿瘤细胞建立的。使用和保存方便，但不能用于疫苗的生产。常用于分离病毒的传代细胞有：HeLa（子宫颈癌）细胞、Hep-2（人喉上皮癌）细胞、KB（鼻咽上皮癌）细胞和Vero（传代非洲绿猴肾）细胞等。
三、病毒在培养细胞中增殖的鉴定指标
将含有病毒的标本接种在敏感的单层细胞，经过培养后，根据不同病毒的特性选择不同的鉴定方法。
细胞病变（cytopathy） 大多数病毒在敏感细胞内增殖后，会引起细胞病变，称细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）（图8-4）。CPE可表现为细胞圆缩、溶解、脱落、融合、形成包涵体，甚至死亡。
图8-4 细胞病变效应
A：未感染病毒的HeLa细胞；B：被柯萨奇病毒B3感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；C：被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列。?200 （李呼伦提供）
不同病毒引起细胞的病变不同，例如：副粘病毒、疱疹病毒和合胞病毒等引起细胞融合；腺病毒引起Hep-2细胞圆缩；呼吸道合胞病毒引起Hep-2细胞融合，形成多核巨细胞。因此观察细胞病变的情况是检测病毒的常用方法。根据选择的细胞类型、细胞病变的种类可对标本中感染的病毒进行判定。但是应当指出，有些病毒虽然在培养细胞中增殖，但是却不引起明显的细胞病变。
根据有无细胞病变来判断病毒感染性和毒力的指标是50%组织细胞感染量（50% tissue culture infectious dose，TCID50）。该方法是将待测病毒作10倍系列稀释，分别接种细胞，经过一定时间后，观察CPE等指标，以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。用统计学方法计算出TCID50。
红细胞吸附（hemadsorption） 有些病毒在细胞内增殖的同时，病毒或其血凝素会出现于感染细胞膜上，使感染细胞能与红细胞结合，称之为红细胞吸附现象。这是检测正粘病毒和副粘病毒的间接指标。如流感病毒在感染细胞后不出现明显的细胞病变，但其血凝素会出现在感染细胞上。在细胞培养中加入红细胞后，后者会吸附在被感染的细胞上。
红细胞凝集（hemagglutination） 某些病毒感染细胞并在细胞内增殖后，从细胞内释放出来。如果这些病毒具有血凝素（hemagglutinin，HA），用细胞培养上清液与红细胞作用，则可出现红细胞凝集现象。这也是一种检测含血凝素病毒的方法。
病毒干扰作用（viral interference） 有些病毒感染细胞后，不产生明显的细胞病变，但是可干扰感染同一细胞的另一种病毒的正常增殖，称为干扰作用。此法可用于检测风疹病毒。风疹病毒在感染猴肾细胞后，不产生细胞病变，但可抑制随后接种的埃可病毒11型在细胞培养中的正常增殖。而埃可病毒单独感染猴肾细胞则可出现明显的细胞病变。
中和试验（neutralization test，NT） 将已知的抗病毒血清先与病毒悬液混合在一起，在一定温度条件下作用一定时间后，接种于敏感细胞进行培养，观察病毒致细胞病变作用或红细胞吸附现象是否消失。这是比较可靠的病毒诊断方法。
空斑形成试验（plaque formation） 是测定病毒数量的一个方法。将适宜浓度的病毒接种于敏感的单层细胞培养中，经一定时间的培养后，在其上方覆盖一层融化的琼脂。继续培养后，单个病毒的复制增殖使局部的单层细胞脱落，形成肉眼可见的空斑（plaque），经染色后更加明显。一个空斑是一个病毒大量复制而成。因此，可通过计算空斑数推算出该样品中病毒的含量。通常以每毫升病毒悬液的空斑形成单位表示（pfu/ml）。该技术可以用于病毒浓度的精确定量和测定抗病毒药物的作用。
四、病毒成分的检测
病毒抗原的检测 一般采用免疫学技术进行病毒抗原的检测，用已知的病毒特异性抗体来检测可疑标本是否含有病毒的抗原。例如：检测HIV和HBV抗原。此类技术操作简便、特异性强、敏感性高、待检样品中不必有完整的病毒体存在，可以节省分离鉴定病毒的时间和繁杂的实验步骤，特别是对于一些血清型别有限的、难以用常规细胞培养技术培养的病毒，更是一个快速而实用的方法。只要具有较高质量的特异性抗体，标本中存在一定量的病毒抗原，可在几小时到1天的时间内完成其检测。经常使用的诊断试剂是单克隆抗体，目前常用的技术是荧光标记技术、酶标记技术（如enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）或放射免疫标记技术。其中ELISA一般用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物，聚苯乙烯微孔板、试管、有机小球等作为固相支持物，试验通过颜色的改变反映标本中是否存在病毒抗原或其量的多少。本实验方法操作简便、价格便宜、比免疫荧光技术敏感，没有放射性污染，因而是最为广泛被应用的一个实验室方法。
病毒核酸的检测 随着分子生物学技术的快速发展，越来越多的病毒基因已被成功地克隆并确定了其核苷酸序列，为通过检测病毒的核酸来对病毒感染性疾病进行临床实验室诊断奠定了良好的基础。
同细菌的核酸诊断技术类似，病毒核酸诊断技术也主要是核酸分子杂交和PCR技术。斑点杂交可用于大多数病毒核酸和PCR产物的检测。原位杂交主要用于细胞内病毒的检测和定位。目前常使用原位杂交技术对人乳头瘤病毒进行检测与分型。Southern印迹法和Northern印迹法可分别用于病毒基因组DNA或RNA的检测。
PCR技术已经广泛用于病毒学研究和病毒感染性疾病的诊断。大多数常见的病毒均有应用PCR技术进行检测的报道。自从PCR技术建立以来，多种不同的PCR技术已经用于病毒的检测。RNA病毒的检测应选择逆转录PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）的方法，先将病毒mRNA反转录为cDNA，再行PCR扩增。原位PCR用于对病毒在细胞内的定位检测，敏感度可达到10个拷贝/细胞。最近出现的实时PCR技术可以检测基因的拷贝数。
基因芯片（gene chip），又称DNA芯片（DNA chip）或cDNA微矩阵列（cDNA Microarray），是根据标记的核酸分子能够与被固化的与之互补配对的核酸分子杂交的原理，利用光刻合成、高速打印或电定位等技术在硅、玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探针，形成DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。因此基因芯片技术在感染性疾病的诊断和流行病学的调查中将会发挥重要作用，这一技术将会有力地推动临床实验室检测水平向前发展。另外，用基因芯片不仅可以同时检测耐药菌的多个耐药基因，还可以同时对多个耐药菌的多个耐药基因进行检测。对临床用药和新药物的合成均具有指导作用。
五、病毒抗体的检测
用已知病毒抗原检测病人血清中有无相应抗体是病毒实验室检查的主要方法手段，也称为病毒的血清学诊断。如前所述，这类技术需要采集病人在急性期和恢复期的双份血清，比较血清效价是否有明显升高。病毒特异性IgG类抗体将恢复期与早期对比，升高4倍或4倍以上方具有诊断意义。因只有单份血清IgG效价的升高不能区分出既往感染或正在感染，很难作为一个辅助诊断的指标。该法不能用于快速诊断。由于抗病毒特异性IgM出现早，消失快，因此在某些病毒性疾病，特异性IgM的出现或升高则表示病毒感染的早期，例如，HBV核心抗原的特异性IgM的出现提示HBV感染的早期。多种免疫学实验方法可用于病毒抗体的检测，包括中和试验、血凝抑制试验、补体结合试验等经典方法，也包括ELISA和蛋白印迹等技术。
中和试验（neutralization test，NT） 病毒在体内或细胞培养中可被特异性抗体中和而失去感染性，根据特异性血清能保护细胞（或鸡胚、动物）不出现病变的稀释倍数判定抗体效价。常用于人群免疫状况调查，临床诊断较少使用。
血凝抑制试验（hemagglutination inhibition test，HI） 有些病毒（如流感病毒）表面有血凝素（HA），能凝集脊椎动物（如鸡、豚鼠和人等）的红细胞，称为血凝现象。但当病毒与其HA特异性抗体作用后，可以阻止病毒表面的HA与红细胞的结合，称为血凝抑制试验。本法可用于正粘病毒、副粘病毒及黄病毒等有HA的病毒的血清学诊断和流行病学调查，也可用于鉴定病毒的型或亚型。
补体结合试验（complement fixation test，CF） 是用已知病毒可溶性抗原检查患者血清中相应抗体，即CF抗体。CF抗体常于病毒感染数日后出现，故可作为近期感染指标。但由于方法繁琐、型特异性较低，临床不常采用。
ELISA法 由于该法具有特异性高、敏感性强、操作方便等优点，目前已经广泛应用于细菌、病毒和其他病原体的临床化验室检测，特别是在病毒感染性疾病的诊断中常用。已经有多种病毒的商品化检测试剂盒，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、各型肝炎病毒、EB病毒和HIV等的诊断。
蛋白印迹技术（Western blot） 是将SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白电泳的高分辨力与酶免疫技术的特异性和敏感性相结合的方法。由于病毒蛋白的分子量和所带电荷不同，在SDS-PAGE上会得到不同的蛋白条带。将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上，进行抗原抗体反应，最后用显色剂（如化学发光物质）显示与相应抗原结合的特异性抗体。本试验是用已经病毒蛋白检测未知病毒特异性抗体的方法。目前WHO规定该试验作为HIV感染的确认试验，现广泛被应用。
第三节 真菌感染的微生物学检查法
对真菌的诊断需要了解真菌寄生的部位，完整的病史，包括职业、业余爱好和旅游史。实验室检查一般采用直接镜检和真菌培养两种方法即可确诊。必要时再进行生化实验、血清学反应或动物接种等。
标本的采集 用无菌操作收集适宜部位的标本，可疑浅部真菌感染应取病变部位的毛发、指（趾）甲屑及皮屑等，可疑深部真菌感染的病人应根据临床症状和体征选取血液、脑脊液或分泌物、排泄物及痰液等并及时检查，一般不超过1～2小时，以免变质污染。
真菌的直接镜检 皮屑、指（趾）甲和毛发等致密而难以透明的标本应先用10%的KOH微加温处理，溶解角质层和细胞基质，然后进行镜检。脓、痰或血标本可直接涂片镜检。镜下观察是否有孢子、菌丝或假菌丝。若怀疑新生隐球菌等有荚膜的真菌感染，根据所致疾病选取标本，经墨汁负染后镜检，见有芽生菌体外围绕着宽厚的荚膜即可做出诊断。
真菌的分离培养 一般用于直接镜检不能确诊时。病原性真菌培养用沙保弱培养基（pH5.6，不适宜细菌生长）培养，为了防止细菌或腐生性真菌的污染，经常加入放线（菌）酮、青霉素、链霉素或其他抑制性抗生素。如果是皮肤、毛发和甲屑等标本，需经70%乙醇或2%石炭酸浸泡2～3分钟杀死杂菌，再经无菌盐水洗净后接种于沙保弱培养基上，在25℃～28℃的条件下培养数日至数周，观察菌落特征。
可疑深部真菌感染的标本可接种于血平板、肉渣培养基或硫酸钠肉汤内，分别在室温和37℃培养数日至数周。必要时可在玻片上做真菌小培养，能在光镜下观察真菌的形态和结构的特点及生长发育的全过程，便于鉴别。阴道或口腔粘膜处标本可直接用棉拭子取材，在血平板上分离。血液标本需事先增菌，脑脊液标本则取其沉淀物接种于血平板上，于37℃培养。若疑为假丝酵母菌，可取菌落接种于0.5ml血清试管内，37℃1h后涂片，革兰染色后镜下见有假丝酵母菌细胞长出芽管即可初步鉴定为白假丝酵母菌。
血清学诊断 可辅助检查深部真菌感染。通常使用的方法是乳胶凝集和补体结合等试验。用乳胶凝集试验可检测脑脊液或血液中新生隐球菌的荚膜抗原，经有效治疗后，其抗原效价下降；但是在AIDS患者合并新生隐球菌感染时，抗原效价经常会在长时间内维持高水平。但主要问题是多种真菌细胞壁缺乏具有免疫原性的成分。
核酸杂交探针技术 已经用于深部感染真菌的特异性鉴定。从培养物中提取RNA，加入标记化学发光化合物的单链DNA探针。当培养物中出现目的真菌，相应的DNA探针与其RNA杂交。本实验方法只需要最小量的真菌生长物（通常少于5天），与经典方法比较，更节省时间，可应用于丝状真菌或酵母型真菌的检查。另有检测真菌DNA中的G+C mol%、随机扩增多态性DNA（RAPD）和PCR限制性酶切片长度多态性分析（PCR-RFLP）等技术的应用。与经典方法比较，这些技术敏感、省时，无疑会推动真菌感染性疾病的诊断水平向前发展。

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