作者：秦海燕 昆明市第一人民医院甘美医院 审稿：
专家审核：宁永忠 清华大学附属垂杨柳医院  微生物学检验报告单1
三天以后追加补充报告： 微生物学检验报告单2
当您看到同一个患者同一份血液标本细菌培养的两张结果完全不一样的检验报告单，您怎么看？ 报告错了？ 标本错了？？ 张冠李戴？？？
 不明白？ 我们一起先来认识一下布鲁氏菌。 一、布鲁氏菌的生物学性状 布鲁氏菌为胞内寄生菌，专性需氧，营养要求高，多数菌株培养时需要多种氨基酸、硫胺素、烟酸和生物素等，可在普通培养基中加入血清或肝渗液进行培养。初次分离需5%-10%的CO2，生长缓慢，培养2-3天出现菌落，4-5天后菌落直径可达2-3mm，菌落无色、半透明、表面光滑、无溶血，革兰染色为革兰阴性球杆菌，革兰染色时碱性复红着色弱，可延长染色时间至3分钟，镜下菌体较小，呈细沙状，偶见集聚成小团。触酶阳性，氧化酶阳性，脲酶快速阳性。
有文献报道使用全自动血培养系统阳性率40-70%，平均培养时间5.7d(3-12d)[1]，并且生长曲线平缓。布鲁菌在自然环境中抵抗力很强，在干燥土壤中可生存数月，在皮毛中、乳及乳制品、冻肉中时间生存较长，对常用的物理消毒方法和化学消毒剂敏感，加热60℃或阳光下暴晒10~20 min可杀死该菌，5％的石灰水、2％的来苏儿、0．2％的漂白粉均可以在数分钟内将该菌杀死。
二、如何抓住容易漏检的布鲁氏菌 由于布鲁氏菌生长比较缓慢，菌落细小，血培养的生长曲线比较平缓，血培养仪器报阳时间较长，通常会超过常规五天报告阴性的时间，很容易在第五天就报告阴性而不再继续观察。
所以我们可以适当增加观察时间，特别是临床医生如果得知患者发病前与家畜或畜产品、布鲁氏菌培养物等有密切接触史，或生活在布鲁菌病流行区，并有发热，乏力，多汗，肌肉和关节疼痛，或伴有肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等表现，高度怀疑是布鲁菌病患者时，应告知微生物室检验人员其流行病学史及临床症状。
检验人员则可延长培养时间至7天及以上，密切关注其生长情况，并进行血培养的盲传，传至平皿后也需延长培养时间至48小时（2天）以上并注意其生长情况，细菌革兰染色时可延长碱性复红染色，或者进行瑞氏染色，便于观察和判断。
另外，虽然血培养是诊断包括布鲁菌病在内的细菌感染的金标准，但布鲁杆菌培养阳性率仅40％~70％。骨髓培养有更高的敏感性，更短的培养时间，尤其对于评估既往用过抗菌药物的患者应优先考虑采取骨髓培养。布鲁氏菌也可从脓液、组织、脑脊液、胸水、关节液和腹水中培养。
而布鲁菌病血清凝集试验是布鲁菌病诊断最常用的简单快速检测手段，但特异性较差，部分阳性结果甚至不能区分是既往感染还是现患感染，仅可作为辅助诊断。
总结三个抓住布鲁氏菌的策略： 1、多与临床医生沟通，仔细询问患者临床症状及接触史。 2、延长培养时间和染色时间，仔细观察细菌菌落形态及染色。 3、必要时增加骨髓培养。
三、检验人员要注意生物安全防护 布鲁氏菌污染环境后形成气溶胶，可发生呼吸道感染，特别是临床微生物室更是布鲁氏菌感染的高危区[2]，若在菌株鉴定处理过程中未严格按照标准进行生物安全防护，易导致实验室人员感染[3]。布鲁氏菌在《人间传染的病原微生物名录》中属于第二类危险程度的细菌，少量样本操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行，而大量活菌操作须在BSL-3级实验室进行，加强实验室防护和标准化操作，防止发生实验室内感染。
四、感染者竟然是老师 近年来，我国布鲁菌病病例主要分布于内蒙古、山西、黑龙江、新疆维吾尔自治区、河北、辽宁、吉林和宁夏回族自治区等省份。布鲁氏菌病(又称布鲁菌病，简称布病)是由布鲁氏菌感染引起的一种呈世界范围分布的人畜共患疾病，是最普遍的动物源性传染病之一，是《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类传染病。患病的羊、牛等疫畜是布病的主要传染源，其主要通过密切接触患病的牛羊后经破损的皮肤伤口或进食未消毒的牛羊奶和奶制品而感染布鲁氏菌。 在开篇我们的这份报告是什么情况呢？培养第四天时，血培养仪报警阳性，抽取培养物涂片革兰染色未见细菌，转种的血平板、中国蓝平板培养2天无细菌生长，于是就认为血培养仪报假阳性，发出血培养阴性报告。如果血培养仪器未报警，按血培养自动仪器厂家推荐的5天培养时间，我们通常也是在第五天发报告“五天培养，无细菌生长”。庆幸的是，转种的平板并没有扔，又继续培养了24小时，意外发现血平板上长出了针尖状、无色、细小薄膜状生长物，通过菌落形态及生长缓慢的特点，怀疑是布鲁氏菌，涂片革兰氏染色，并延长碱性复红染色的时间至3分钟，镜下仔细观察，发现革兰阴性小杆菌，菌体较小，呈细沙状，做触酶、氧化酶、脲酶试验，结果均为阳性。采用VITEK-2-Compact全自动微生物鉴定仪进行鉴定，最终确认为羊布鲁菌。 立即联系主管医生，得知患者是教师，并无牛羊接触史，抽血做初筛试验，平板凝集试验(PAT)结果为阳性。再次询问患者，才知道，虽无牛羊接触史，但其居住地常有私人牵羊在路边现场挤出的新鲜生羊奶出售，最近几个月经常买来稍加热就喝，因此判断此患者是由于感染了羊布鲁菌而导致布鲁氏菌病。但布鲁氏菌在《人间传染的病原微生物名录》中属于危险程度分类的第二类细菌，大量活菌操作必须在BSL-3级实验室进行，由于多方面的原因，布鲁菌的常规药敏试验并未开展。  （图片来自苏州大学附属第一医院徐杰《人布鲁氏菌病的致病机理、疫情与防治》） 图1 布鲁氏菌染色和培养 五、布鲁氏菌的临床诊断与治疗 布鲁氏菌可侵犯人体的网状内皮系统，引起多系统多器官损害[4]。潜伏期一般为1-3周，平均为2周。部分病例潜伏期更长。急性期病例以发热、乏力、多汗、肌肉、关节疼痛和肝、脾、淋巴结肿大为主要表现。慢性期病例多表现为关节损害、长期发热等等。多样的临床表现增加了临床医生对布鲁菌感染做出早期、正确诊断的难度，导致误诊。有报道临床有将布鲁菌病误诊为风湿病、结核病、腰椎病、淋巴瘤及系统性红斑狼疮等。 [size=1em]01 [size=1em]布鲁氏菌病的诊断： 应结合流行病学史、临床表现和实验室检查进行诊断。 （1）流行病学史：发病前与家畜或畜产品、布鲁氏菌培养物等有密切接触史，或生活在布病流行区的居民等。 （2）临床表现：临床症状多样，可引起发热、乏力、多汗、腰背痛、肌肉和关节疼痛，或伴有肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等表现。 （3）实验室检查： ①细菌培养检出布鲁氏菌是“金标准”。 ②白细胞计数多正常或偏低，淋巴细胞相对增多，有时可出现异常淋巴细胞，少数病例红细胞、血小板减少。 ③平板凝集试验：虎红平板(RBPT)或平板凝集试验(PAT)结果为阳性，可用于初筛。试管凝集试验(SAT)：滴度为1：100++及以上或 病程一年以上滴度1：50++及以上；或半年内有布鲁氏菌疫苗接种史，滴度达1：100++及以上者。 [size=1em]02 [size=1em]布鲁氏菌病的抗菌治疗： 布鲁杆菌为胞内寄生菌，治疗时需选择能够渗透至巨噬细胞内，且在细胞内酸性环境能发挥作用的药物。根据《布鲁菌病诊疗专家共识》原则为早期、联合、足量、足疗程用药，必要时延长疗程，以防止复发及慢性化。常用四环素类、利福霉素类药物，亦可使用喹诺酮类、磺胺类、氨基糖苷类及三代头孢类药物[5,6]。WHO推荐的方案为口服多西环素200mg/d,联合利福平600-900mg/d,坚持使用6-8周[7]。治疗过程中注意监测血常规、肝肾功能等。 六、布鲁氏菌的预防 人群中布鲁菌病的发生主要受该地区动物布鲁菌病疫情的影响。为了消灭布鲁菌病，世界卫生组织在 1998 年就提出了三方面工作重点，阻断动物间传播，对无布鲁菌病的畜群和地区持续监测；诊断、扑杀受感染动物，建立无布鲁菌病的畜群和地区；给动物接种免疫，以减少流行[8]。目前在使用的疫苗主要预防羊种( B.melitensis ) 和牛种布鲁菌( B. abortus)引起的疾病, 均为减毒活疫苗, 包括 B. abortus strain 19 ( S19 )、B.abortus RB51、B.melitensis Rev. 1、B.suis strain S2 等。接种途径为肌肉注射、皮下注射或结膜接种[10]。现有的动物用疫苗均能感染人且造成一定危害，因此不能用于人布鲁菌病的预防。 参考文献： [1]贾斌,张峰波,等.血液检出布鲁氏菌阳性患者的实验室及临床特点分析[J].新疆医科大学学报,2017,40（2）：136-140. [2]崔恩博,鲍春梅,郭桐生,等.布氏菌病的流行趋势及诊断[J].传染病信息,2010,23(1):20-22. [3] 徐卫民,王衡,施世锋,等.浙江1例实验室感染布鲁菌病病例及其警示[J].中国地方病防治杂志,2010,25(1):58. [4]Engin D O,Erdem H,Gencer S,et al.Liver involvementin patients with brucellosis:results of the Marmara study[J].Eur J ChinMicrobiol Infect Dis,2014,33(7):1253-1262. [5]中华人民共和国卫生部.布鲁氏菌病指南（试行）[J].传染病信息，2012,25（6）：323-359. [6]中华传染病杂志编辑委员会.布鲁菌病诊疗专家共识[J]中华传染病杂志，2017, 35（ 12）：705-710. [7]Versalovic J, Carroll KC, Funke G，et al .Manual of Clinical Microbiology［M］.10thed.Washington,DC：ASMPress ，2011 [8]Nikolaos S. Human andanimal brucellosis damascus, Syria [ R] . WHO / MZCP Report, 1998 [9]Zhong Z, Yu S,Wang X, et al. Human brucellosis in the People’s Republic of China during2005-2010[J]. Int J Infect Dis,2013,17(5):e289-292. [10]Olsen SC,Stoffregen WS. Essential role of vaccines in brucellosis control and eradication programs for livestock [ J ] .Expert Rev Vaccines, 2005, 4(6) : 915- 928. |
