顾兵教授团队最新研究，有望从根本上解决细菌耐药难题！

细菌是一种微小的生命，它们存在于我们的身体和周围的环境中，一些细菌会引起人体各种感染性疾病，临床上通常会使用抗生素等抗菌药物进行治疗。然而，细菌的一种特殊结构——生物被膜，却能让他们“防御”住药物的作用。

生物被膜是一种由细菌在固体或液体表面形成的复杂而结构化的多层聚合物结构，就像是一个细菌的“城堡”。在这个城堡里，细菌可以通过共享基因来传递耐药性，也可以通过被膜的物理阻隔来抵抗抗菌药物的侵入。因此，生物被膜中的细菌的耐药性可以提高1000倍以上，使得抗菌药物无法发挥抑菌作用。据统计，临床80%的感染性疾病难以清除的原因在于细菌生物被膜的形成。

近日， 广东省人民医院检验科顾兵教授研究团队的一项研究发现，希瓦氏菌H-NS蛋白的乙酰化可通过降低氮代谢关键调控因子glnA的表达，进而降低细胞内含氮物质的关键氨基酸——谷氨酰胺的含量，从而抑制生物被膜形成。细菌生物被膜的形成需要H-NS蛋白去乙酰化，才能使谷氨酰胺的合成通路处于“开启”状态，进而促进细菌生物被膜形成。该研究有望从根本上解决细菌耐药难题。该研究发表在NucleicAcids Research杂志上（Q1区，IF=14.9）。

首先，研究人员使用希瓦氏菌野生型菌株作为对照，评估了先前构建的hns缺失菌株的薄膜和附着生物膜，发现hns的缺失明显消除了薄膜和附着生物膜的形成，而重新引入野生型hns基因，则恢复了其生物膜的形成。

为了研究H-NS在希瓦氏菌生物膜形成过程中的细胞分子变化，研究人员采用质谱法分析鉴定H-NS蛋白的翻译后修饰位点，发现共有四个赖氨酸（K）残基K19，K32，K35和K116被乙酰化修饰，其中K19位点的乙酰化则抑制了希瓦氏菌的生物被膜的形成。

研究人员构建了相应的H-NS突变体，通过赖氨酸到精氨酸（Kto R）或赖氨酸到谷氨酰胺（Kto Q）的突变，模拟了H-NS的非乙酰化和乙酰化状态。量化了H-NS的Kto Q突变体和KtoR突变体在附着生物膜形成中的作用。结果显示，H-NS在K19位点的乙酰化消除了希瓦氏菌的附着生物膜形成。相反，非乙酰化的H-NS突变体K19R恢复了其生物膜形成。而其他突变体对生物被膜的形成没有明显影响，从而揭示H-NS对希瓦氏菌的生物膜形成是必需的，且K19位点应保持非乙酰化状态以维持生物膜的形成。

该研究使用高通量RNA测序技术，比较了野生型和H-NS在K19位点发生突变菌株的基因表达差异。结果发现，H-NS的乙酰化修饰可以抑制一些氮代谢相关的基因，如glnA,glnK,gltB等，从而影响细胞内谷氨酰胺的合成和氮平衡的调节。这些基因在H-NS突变菌株中显著下调，而一些被H-NS沉默的基因，如speF和SO_2119等，在突变菌株中上调。表明H-NS的乙酰化修饰在细菌的氮代谢和生物膜形成中起着重要的作用。

研究人员测定了不同菌株的细胞内谷氨酰胺的含量，发现K19Q突变体和H-NS缺失菌株的谷氨酰胺含量显著低于野生型菌株。研究人员推测，谷氨酰胺是细胞内氮平衡的关键物质，其含量的降低会影响生物被膜的形成。

随后，应用电泳迁移率分析（EMSA）技术，探究了H-NS蛋白及其突变体与glnA和glnB启动子区域的结合能力。发现H-NS蛋白及其突变体都能够与这两个启动子区域结合，但是K19Q突变体对glnA启动子区域的结合能力更强，而K19R突变体对glnB启动子区域的结合能力更强。这些结果与qPCR的结果一致，说明H-NS蛋白的乙酰化修饰可以调节其与DNA的亲和力，从而影响基因的表达。

鉴于生物膜的形成与氮代谢有关。研究人员进一步研究了细胞内氮浓度对H-NS乙酰化状态的潜在影响。在氮饥饿条件，模拟生物被膜形成的环境，发现在这种条件下，H-NS蛋白的乙酰化水平降低，而氮代谢调控因子glnB的三聚体水平升高。

研究人员推测，glnB的三聚体可以通过反馈抑制H-NS蛋白的乙酰化，从而促进glnA的表达和谷氨酰胺的合成。总之，在缺氮条件下，在生物膜形成过程中可能遇到glnA和氮源转运蛋白系统的转录受到glnB修饰三聚体化的广泛刺激，相反，在氮充足的条件下，glnA和氮转运蛋白系统都保持在低转录水平。

通过代谢组学分析，该研究比较了不同菌株在生物被膜形成过程中的氨基酸代谢变化。结果发现，生物被膜形成过程中，谷氨酰胺的合成途径被激活，而精氨酸的合成途径被抑制，进一步说明了氮代谢的调节在生物被膜形成中的重要性。

总之，细菌的生物被膜形成是一个复杂的过程，受到多种因素的影响，其中氮是一个重要的因素，细菌需要维持适当的氮平衡，才能有效地形成生物被膜。细菌的氮平衡受到多层次的调节，包括基因、蛋白质、代谢等，其中H-NS是一个关键的调节因子，它可以通过乙酰化修饰来改变其DNA结合活性，从而影响细菌的氮代谢相关基因的表达。细菌H-NS的乙酰化修饰是一个动态的过程，受到细菌的基因和环境的影响，细菌可以根据不同的条件来调节H-NS的乙酰化水平，从而调节细菌的生物被膜形成和氮平衡。

该研究揭示了细菌全局调控因子H-NS的乙酰化修饰如何影响细菌的生物被膜形成和氮代谢，展示了希瓦氏菌如何通过H-NS的乙酰化来微调细胞内的氮平衡，以适应不同的环境条件，为细菌的基因表达调控和代谢适应机制提供了新的视角和证据。为细菌的生理生态学和环境工程学提供了新的知识和思路，为进一步研究细菌的生物被膜形成的分子机制和调控网络提供了新的线索和方法，为开发新的抗生物被膜和抗耐药的策略和药物提供了新的靶点和方向。