在医疗机构中，几乎所有的医疗活动都离不开水。预防与控制水源性病原微生物的传播，是医院感染管理的重要任务之一。围绕医疗用水的污染环节、医疗机构水源性感染暴发、以及医疗机构用水微生物检测策略与技术等等与水分不开的话题，倪教授为大家带来了10多期精彩讲座。 大家对水源性微生物相关特点和检测也有了初步的认识。今天我们迎来该专题的最后一讲——“接种方式对检出率的影响及微生物鉴定系统的局限性”。一起来学习吧。 接种方式对检出率的影响及微生物鉴定系统的局限性 一、接种方式对检出率的影响 1.倾注培养技术的局限性 PCA技术操作简便、价格低廉、应用广泛，但是该技术也有其局限性。 1.1 培养基倾倒是要求温度控制在45℃左右，但既是这个温度对于水样中的细菌也是不小的“热冲击”，何况是受损的细菌。如实验人员温度控制规范，甚至出现更高温度，对细菌的“热冲击”力度就更大了，平皿出现“白板”的几率就更大了。 1.2 倾注培养的程序，预先滴加检样，再倾注融化的培养基。因此，细菌往往是生长在培养基之下，这样给后续的细菌鉴定带来了困难。 1.3 倾注培养通常使用的剂量为1mL～2mL，如果采样液为10mL，那么倾注培养的结果仅代表采样液信息的1/10。采样液中的细菌经过预处理（震荡、吹打等）后，因质量不同而处于不同的液体层面，而每位实验人员吸取的习惯不一，吸取采样液的表面、中层或底部等，导致吸取的细菌数量是有差异的，培养结果不能正确反映真实的细菌数量。 2．涂布法接种 涂布法接种的程序，选好已浇注凝固的培养基，如是取自冰箱保存的平皿，最好先在37℃培养箱内复温，然后吸取0.1mL～0.5mL检样至培养基表面，使用无菌“L”棒均匀涂布，待水分吸干后，翻转平皿送指定培养箱培养。 涂布法的最大好处是便于后续的细菌鉴定，便于转种培养。有研究显示，该技术平均细菌的计数高于倾注法。但是，该技术同倾注法，因检样剂量有限，故给出的信息有限。另外，应尽可能涂布更多检测样本，可以获取更多信息，推荐每块平皿涂布0.25mL采样液，共涂布4块，这样将4块平皿上细菌菌落相加，即为1mL采样液中细菌菌落总数。 3、薄膜过滤法 由Taylor和Geldreich（1979）报道的一种新型的水样细菌检测的方法。该技术尤其适用于低浊度、低污染的水样，最大的优点是不受检样剂量的限制，数百，甚至上千毫升的剂量，可一次性将全部样品中的细菌过滤在一张薄膜上，将薄膜转移至选定的培养基表面，送指定的培养箱培养。 有研究显示，722份水样，如检样取100mL，有35.9%（259/722）平皿未见细菌生长；当采样液剂量扩大至300mL，未见细菌的平皿只有24.4%（176/722）。由此可见，采样液的剂量越大越能检出更多的异养菌数量，越接近异养菌实际污染的状况。 有研究显示，薄膜过滤法技术检出的细菌种类、数量明显高于倾注法、涂布法，且便于后续的细菌鉴定与转种培养；但是昂贵的设备与耗材，可能是影响该技术在基层单位推广应用的一个因素。
二、微生物鉴定系统的局限性 1、传统生化鉴定的局限性 传统上，细菌和真菌的鉴定是基于常规生化管的反应，将结果与历史积累的种属预期反应谱进行比对所得出的鉴定结论。传统鉴定主要方法是观察培养基的变色反应和物理特征，如菌落形态和气味、革兰染色、凝集试验、氧化反应等。通常其鉴定水平只能达到属级，细菌的种级鉴定就更难了，突变株就望尘莫及了。另一个方面，生化反应耗时，如以pH为基础的生化反应鉴定时间通常在15h～24h。 2.微生物自动化鉴定系统 由于临床需要快速而简便的检测方法，因此出现了以手工生化为基础的试剂盒和半自动化鉴定系统，直至上个世纪70年代问世的全自动微生物鉴定仪。初期，这类自动化鉴定仪是依靠微生物的生化特征、脂肪酸构成以及其他代谢产物来鉴定。而近年来兴起的基于蛋白质组学技术对细菌或真菌进行鉴定全自动鉴定仪—基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF MS）（见图6）。当然，以核酸为基础的技术，包括广谱DNA目标序列分析、微阵列和微生物特异性扩增技术也是不少临床微生物实验室用于微生物鉴定的方法。由于自动化鉴定设备与耗材昂贵，一般基层医疗机构使用受限。
图6. MALDI-TOF MS 3、微生物自动化鉴定系统局限性 同样，全自动鉴定仪的一个重要问题就是数据库，数据库的大小直接决定了其先进性。为此，微生物自动化鉴定系统的数据库应经常更新，以涵盖新命名的物种。例如，阪崎肠杆菌（阴沟肠杆菌产黄色素的突变株）未被加入部分自动化鉴定系统的数据库，那么该系统只会报告阴沟肠杆菌，而临床上也就无法将阪崎肠杆菌与新生儿脑膜炎相关联。为此，临床医生需要了解本单位自动化鉴定系统的数据库版本与更新情况，避免临床误诊或漏诊。 结 语 虽然暴露于饮用水是HAIs发生的来源，而明确暴露途径是预防HAIs的关键，多数流行病学调查的焦点放在病原体，常常忽略环境来源的病原体，这是预防水源性HAIs发生关键问题。建立病原微生物与环境来源的流行病学关系是有一定的难度，从水体中检出病原体也是相当困难的，通常从水体中检出的病原体与引发感染的往往不是同一个克隆株。为此，我们在开展感染的流行病学调查过程中，应思考用于环境监测的策略与技术，使我们的感控人员成为“千里眼”，有效捕捉到引发感染的凶手，为患者诊疗安全保驾护航。 对于医疗机构的重点用水部门，应根据国家相关规定定期开展水源微生物检测，尤其是重点科室，可以在执行国家规定的检测方法的同时，部分或全部开展R2A培养的平行标本，为全面了解医疗机构水源性异养菌污染情况提供参考数据；定期检查用于水处理的消毒程序和设备运行状况；开展水源性感染的风险评估，以确保各项控制措施的有效性，预防水源性感染暴发事件的发生。 主要参考文献 1.Reasoner DJ, Geldreich EE, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49: 1-7. 2.Byrd JJ, Xu HS, Colwell RR, Viable but nonculturable bacteria in drinking water[J].Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57: 875-8. 3. 白晓慧，吴汉靓，王海亮，等. 饮用水中异养菌平板计数检测方法的比较[J].净水技术，2004,26（5）：65-67. 4. 顾孔珍，线纯，罗岳平，用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率[J].净水技术，2004,23（1）：42-44. 5. Williams MM,Armbruster CR,Arduino MJ, Plumbing of hospital premises is a reservoir for opportunistically pathogenic microorganisms: a review[J].Biofouling, 2013, 29: 147-62. 6. 李文明，李伟英，陆辉，等. 供水管网水样R2A培养基细菌总数测定及其影响因素探究[J].净水技术，2014,33（6）：66-70. 7. 李珏，洪利娅，王知坚，等. 制药用水微生物限度检查新方法的研究[J].药物分析杂志，2014,34（2）：376-379. 8. Capelletti RV, Moraes ÂM, Waterborne microorganisms and biofilms related to hospital infections: strategies for prevention and control in healthcare facilities[J].J Water Health, 2016, 14: 52-67. 9. Safiri S, Ayubi E, Pseudomonas aeruginosa Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit Attributed to Hospital Tap Water: Methodological and Statistical Issues to Avoid Misinterpretation[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38: 1126-1127. 10. Bédard E, Laferrière C, Déziel E et al. Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buildings[J].PLoS ONE, 2018, 13: e0199429. |
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