前两期讲座中我们学习了R2A培养基的研发和应用，本期一起来了解影响水体中异养菌检测的因素。 影响水体中异养菌检测的因素 1.水体中异养菌处于动态平衡 水中的悬浮菌会受到范德华力、静电、氢键等作用力与管道内壁接触并粘附，同时管壁生物膜中的细菌在水流的冲击下可以从管壁脱离，形成浮游菌。因此，水中的细菌和管壁生物膜中的细菌处于动态平衡中。相对而言，水温对细菌的检出率与数量有较明显的影响（见图1），当水温较低时，水体中微生物的生长和繁殖较缓慢，随着水温的升高，微生物的生长速度明显加快。
图1 水温对异养菌检出率的影响 2.不同培养基的对比实验 一项针对某市城市饮用水中微生物指标检测结果显示，采用R2A培养基，28℃和37℃环境下培养7d，与PCA、mSPC（蛋白胨20g，明胶25g，琼脂15g，甘油10g，蒸馏水1.0L。）、TSA-SB（胰蛋白胨17g，植物蛋白胨3g，氯化钠5g，K2HPO4 2.5g，葡萄糖 2.5g，蒸馏水1.0L；外加5%绵羊血（sheep blood），该培养基更适合人类病原体的检测。一些潜在的人类病原微生物在这种培养基上生长较快。）3种培养基37℃培养3d进行对比研究，上述不同培养基，在不同温度下的3d的HPC计数结果显示，R2A培养基加28℃培养条件，检出的异养菌数量最多（见图2）。
图2 不同培养基检测异养菌的比较结果 从上图可见，PCA培养基是一种传统的富营养培养基，培养3d结果显示为1～2 CFU/mL，符合国家生活饮用水的微生物指标。mSPC类似于PCA培养基，也是富营养型的培养基，其检测结果同PCA。TSA-SB检测结果略高于PCA、mSPC，平均检测结果为2～4 CFU/mL，也是符合国家标准。而R2A的检测结果显示，明显高于其他3种富营养型培养基，且28℃培养温度下的结果又是37℃的数倍。 3.培养时间 细菌总数通常会随着培养时间延长而增加。一般情况下，12d～14d可达到最高技术，但在6d之前生长速度最快，7d以后逐渐趋于稳定增长。对于PCA培养技术，最快增长期在前2d～4d。 R2A培养基在28℃条件下，随着培养时间增加，菌落数明显增多（见图3），在3d（此时的细菌菌落数是7d的1/3。注：可以利用这个现象进行预测，较早采用干预措施，而不必等到7d的培养结果。）后增加明显，但在7d后趋于稳定。
图3 R2A培养基不同培养时间异养菌的检出 4.培养温度 出于对人体肠道生理特点的考虑，以往在设置细菌培养温度时采用37℃的培养温度，以后又降为35℃的培养温度。但是在上个世纪80年代以来，有研究提出，对水源性异养菌采用该温度并不科学，因为更多的能水中存活，甚至生长繁殖的细菌并不适合这个温度。检测水中异养菌更应考虑到该类生物体已经长期适应了水环境。经大量研究，多数学者赞同采用22℃，或28℃温度，这样的培养温度更接近环境细菌原有的生活环境。 中温培养（35℃～37℃）加短时间（24h～48h）的培养策略，有利于人体和动物体内的细菌生长；低温培养（20℃～28℃）加长时间培养（5d～7d），则有利于水源环境中的细菌生长。 5.不同培养温度对R2A培养基的影响 采用不同的培养温度对R2A培养基检出率的影响较大，28℃培养条件下的检出数量明显高于37℃的培养温度；甚至在培养7d时，37℃的培养温度结果符合国家微生物指标；但28℃培养结果却超过国家的标准（见图4）。
图4 R2A培养基不同温度异养菌的检出 6.不同接种方法对R2A培养基的影响 检样的接种方式对于R2A培养基异养菌的检出率具有一定的影响。倾注法与涂布法比较表明，涂布法细菌菌落数高于倾注法。倾注法是采用培养基冷却至45℃左右时，倾倒至含有样本的平皿中，因此，细菌要接受热冲击的考验；而涂布法是直接将检样涂布在凝固的琼脂表面，没有热冲击现象。因此，有学者推测，原有已经受到损伤的异养菌，再加上“热冲击”的打击，如同“雪上加霜”再也恢复不了生长的能力。 7.R2A培养基的局限性 R2A培养基适用于采用氯消毒水体中异养菌的检测。但是需要提醒的是，R2A培养基也不是什么神话，它只是让我们进一步了解环境中异养菌污染现状的一个手段。不排出由于地区差异、水体有机物浓度，以及初次污染细菌的种类、生理、生化等特性，均会影响R2A培养基的检出率，甚至会出现比PCA培养基检出率、计数更低的现象。有研究发现，当水体细菌污染程度较重，PCA检测结果出现较较重的细菌超标时，R2A培养基的结果反而不尽人意，甚至出现菌落计数低于PCA培养结果的现象。由此可见，R2A培养基适用于极度贫营养环境中的异养菌的检测，而PCA培养基是则适合污染较重水体的检测。 8.水样的采集
我们应该严格执行国家标准，规范采集水样，避免人为污染造成的细菌总数超标。同时，可以通过采集水样的剂量来了解不同水路管网的污染程度，可以针对性地采取清洁消毒措施，消除感染隐患。下面给大家介绍有关通过采集水样的剂量，结合计数水管截面积与体积，推测哪段水路,包括水龙头、曝气器等设备的污染现状。 Bédard等（2018）采样时水龙头不消毒，放水时立即采样，以及滞留1h、24h、48h、72h、120h和240h采样，每个系统（冷水和热水）各采集6份水样。采样点水龙头第1升水样是连续分别采集，第1瓶15ml、第2瓶35ml、第3瓶200ml、第4瓶250ml、第5瓶500ml（图5）。放水2L和5L后再采集2瓶250ml。最后1瓶放水5min后采样，约9.1L，平均流量为0.9L/min。
图5 管道内水样对应的部位与每节水管的表面-体积比示意图 水样4℃保存与运送，水样在24h内完成实验。HPCs采用R2A琼脂、置22℃、7d培养。本研究结果表明，细菌总数的最大值是发生在滞留1h后，最初的15mL的水样，细菌菌落数为4×102 CFU/mL，这也提示在前端管道内形成较小的生物膜，细菌菌量在2.8×105 CFU/cm2 和 3.1×106 CFU/cm2。这些结果强有力地表明，生物膜的存在是水龙头和水路管道水体中细菌增加的重要因素。同时，通过水量的计数也可以推测水路中污染的部位与地点。 主要参考文献 1.Reasoner DJ, Geldreich EE, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49: 1-7. 2.Byrd JJ, Xu HS, Colwell RR, Viable but nonculturable bacteria in drinking water[J].Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57: 875-8. 3. 白晓慧，吴汉靓，王海亮，等. 饮用水中异养菌平板计数检测方法的比较[J].净水技术，2004,26（5）：65-67. 4. 顾孔珍，线纯，罗岳平，用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率[J].净水技术，2004,23（1）：42-44. 5. Williams MM,Armbruster CR,Arduino MJ, Plumbing of hospital premises is a reservoir for opportunistically pathogenic microorganisms: a review[J].Biofouling, 2013, 29: 147-62. 6. 李文明，李伟英，陆辉，等. 供水管网水样R2A培养基细菌总数测定及其影响因素探究[J].净水技术，2014,33（6）：66-70. 7. 李珏，洪利娅，王知坚，等. 制药用水微生物限度检查新方法的研究[J].药物分析杂志，2014,34（2）：376-379. 8. Capelletti RV, Moraes ÂM, Waterborne microorganisms and biofilms related to hospital infections: strategies for prevention and control in healthcare facilities[J].J Water Health, 2016, 14: 52-67. 9. Safiri S, Ayubi E, Pseudomonas aeruginosa Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit Attributed to Hospital Tap Water: Methodological and Statistical Issues to Avoid Misinterpretation[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38: 1126-1127. 10. Bédard E, Laferrière C, Déziel E et al. Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buildings[J].PLoS ONE, 2018, 13: e0199429. |
/1 
