前两期讲座中我们学习了R2A培养基的研发和应用,本期一起来了解影响水体中异养菌检测的因素。 影响水体中异养菌检测的因素 1.水体中异养菌处于动态平衡 水中的悬浮菌会受到范德华力、静电、氢键等作用力与管道内壁接触并粘附,同时管壁生物膜中的细菌在水流的冲击下可以从管壁脱离,形成浮游菌。因此,水中的细菌和管壁生物膜中的细菌处于动态平衡中。相对而言,水温对细菌的检出率与数量有较明显的影响(见图1),当水温较低时,水体中微生物的生长和繁殖较缓慢,随着水温的升高,微生物的生长速度明显加快。 图1 水温对异养菌检出率的影响 2.不同培养基的对比实验 一项针对某市城市饮用水中微生物指标检测结果显示,采用R2A培养基,28℃和37℃环境下培养7d,与PCA、mSPC(蛋白胨20g,明胶25g,琼脂15g,甘油10g,蒸馏水1.0L。)、TSA-SB(胰蛋白胨17g,植物蛋白胨3g,氯化钠5g,K2HPO4 2.5g,葡萄糖 2.5g,蒸馏水1.0L;外加5%绵羊血(sheep blood),该培养基更适合人类病原体的检测。一些潜在的人类病原微生物在这种培养基上生长较快。)3种培养基37℃培养3d进行对比研究,上述不同培养基,在不同温度下的3d的HPC计数结果显示,R2A培养基加28℃培养条件,检出的异养菌数量最多(见图2)。 图2 不同培养基检测异养菌的比较结果 从上图可见,PCA培养基是一种传统的富营养培养基,培养3d结果显示为1~2 CFU/mL,符合国家生活饮用水的微生物指标。mSPC类似于PCA培养基,也是富营养型的培养基,其检测结果同PCA。TSA-SB检测结果略高于PCA、mSPC,平均检测结果为2~4 CFU/mL,也是符合国家标准。而R2A的检测结果显示,明显高于其他3种富营养型培养基,且28℃培养温度下的结果又是37℃的数倍。 3.培养时间 细菌总数通常会随着培养时间延长而增加。一般情况下,12d~14d可达到最高技术,但在6d之前生长速度最快,7d以后逐渐趋于稳定增长。对于PCA培养技术,最快增长期在前2d~4d。 R2A培养基在28℃条件下,随着培养时间增加,菌落数明显增多(见图3),在3d(此时的细菌菌落数是7d的1/3。注:可以利用这个现象进行预测,较早采用干预措施,而不必等到7d的培养结果。)后增加明显,但在7d后趋于稳定。 图3 R2A培养基不同培养时间异养菌的检出 4.培养温度 出于对人体肠道生理特点的考虑,以往在设置细菌培养温度时采用37℃的培养温度,以后又降为35℃的培养温度。但是在上个世纪80年代以来,有研究提出,对水源性异养菌采用该温度并不科学,因为更多的能水中存活,甚至生长繁殖的细菌并不适合这个温度。检测水中异养菌更应考虑到该类生物体已经长期适应了水环境。经大量研究,多数学者赞同采用22℃,或28℃温度,这样的培养温度更接近环境细菌原有的生活环境。 中温培养(35℃~37℃)加短时间(24h~48h)的培养策略,有利于人体和动物体内的细菌生长;低温培养(20℃~28℃)加长时间培养(5d~7d),则有利于水源环境中的细菌生长。 5.不同培养温度对R2A培养基的影响 采用不同的培养温度对R2A培养基检出率的影响较大,28℃培养条件下的检出数量明显高于37℃的培养温度;甚至在培养7d时,37℃的培养温度结果符合国家微生物指标;但28℃培养结果却超过国家的标准(见图4)。 图4 R2A培养基不同温度异养菌的检出 6.不同接种方法对R2A培养基的影响 检样的接种方式对于R2A培养基异养菌的检出率具有一定的影响。倾注法与涂布法比较表明,涂布法细菌菌落数高于倾注法。倾注法是采用培养基冷却至45℃左右时,倾倒至含有样本的平皿中,因此,细菌要接受热冲击的考验;而涂布法是直接将检样涂布在凝固的琼脂表面,没有热冲击现象。因此,有学者推测,原有已经受到损伤的异养菌,再加上“热冲击”的打击,如同“雪上加霜”再也恢复不了生长的能力。 7.R2A培养基的局限性 R2A培养基适用于采用氯消毒水体中异养菌的检测。但是需要提醒的是,R2A培养基也不是什么神话,它只是让我们进一步了解环境中异养菌污染现状的一个手段。不排出由于地区差异、水体有机物浓度,以及初次污染细菌的种类、生理、生化等特性,均会影响R2A培养基的检出率,甚至会出现比PCA培养基检出率、计数更低的现象。有研究发现,当水体细菌污染程度较重,PCA检测结果出现较较重的细菌超标时,R2A培养基的结果反而不尽人意,甚至出现菌落计数低于PCA培养结果的现象。由此可见,R2A培养基适用于极度贫营养环境中的异养菌的检测,而PCA培养基是则适合污染较重水体的检测。 8.水样的采集 我们应该严格执行国家标准,规范采集水样,避免人为污染造成的细菌总数超标。同时,可以通过采集水样的剂量来了解不同水路管网的污染程度,可以针对性地采取清洁消毒措施,消除感染隐患。下面给大家介绍有关通过采集水样的剂量,结合计数水管截面积与体积,推测哪段水路,包括水龙头、曝气器等设备的污染现状。 Bédard等(2018)采样时水龙头不消毒,放水时立即采样,以及滞留1h、24h、48h、72h、120h和240h采样,每个系统(冷水和热水)各采集6份水样。采样点水龙头第1升水样是连续分别采集,第1瓶15ml、第2瓶35ml、第3瓶200ml、第4瓶250ml、第5瓶500ml(图5)。放水2L和5L后再采集2瓶250ml。最后1瓶放水5min后采样,约9.1L,平均流量为0.9L/min。 图5 管道内水样对应的部位与每节水管的表面-体积比示意图 水样4℃保存与运送,水样在24h内完成实验。HPCs采用R2A琼脂、置22℃、7d培养。本研究结果表明,细菌总数的最大值是发生在滞留1h后,最初的15mL的水样,细菌菌落数为4×102 CFU/mL,这也提示在前端管道内形成较小的生物膜,细菌菌量在2.8×105 CFU/cm2 和 3.1×106 CFU/cm2。这些结果强有力地表明,生物膜的存在是水龙头和水路管道水体中细菌增加的重要因素。同时,通过水量的计数也可以推测水路中污染的部位与地点。 主要参考文献 1.Reasoner DJ, Geldreich EE, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49: 1-7. 2.Byrd JJ, Xu HS, Colwell RR, Viable but nonculturable bacteria in drinking water[J].Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57: 875-8. 3. 白晓慧,吴汉靓,王海亮,等. 饮用水中异养菌平板计数检测方法的比较[J].净水技术,2004,26(5):65-67. 4. 顾孔珍,线纯,罗岳平,用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率[J].净水技术,2004,23(1):42-44. 5. Williams MM,Armbruster CR,Arduino MJ, Plumbing of hospital premises is a reservoir for opportunistically pathogenic microorganisms: a review[J].Biofouling, 2013, 29: 147-62. 6. 李文明,李伟英,陆辉,等. 供水管网水样R2A培养基细菌总数测定及其影响因素探究[J].净水技术,2014,33(6):66-70. 7. 李珏,洪利娅,王知坚,等. 制药用水微生物限度检查新方法的研究[J].药物分析杂志,2014,34(2):376-379. 8. Capelletti RV, Moraes ÂM, Waterborne microorganisms and biofilms related to hospital infections: strategies for prevention and control in healthcare facilities[J].J Water Health, 2016, 14: 52-67. 9. Safiri S, Ayubi E, Pseudomonas aeruginosa Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit Attributed to Hospital Tap Water: Methodological and Statistical Issues to Avoid Misinterpretation[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38: 1126-1127. 10. Bédard E, Laferrière C, Déziel E et al. Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buildings[J].PLoS ONE, 2018, 13: e0199429. |