在医疗机构中，几乎所有的医疗活动都离不开水。预防与控制水源性病原微生物的传播，是医院感染管理的重要任务之一。 在日常监测工作中，我们常采集重点科室水样标本送检，那么其检测结果准确吗？检测技术又受哪些因素影响？请继续聆听医疗用水系列讲座之“现有水源性微生物检测技术的挑战”
现有水源性微生物检测技术的挑战 1、检测技术的局限性 知道检样中“活细菌”的真实数量，以及所采用的检测技术的敏感度，是很困难的。一些微生物学者认为，具有完整的细胞结构，或具有代谢活性，或具备分离繁殖能力，或保存mRNA的，只要能满足其中一条标准的细菌，即可判定为“活细胞”。因此，在临床上唯一可作为活细菌检测的标准就是，让检样中的细菌复苏与生长，在指定的培养基上形成可见的菌落。但是任何一款培养基和培养条件，都不可能适用所有种类细菌的生长。因此，检测方法的选择不当，可能造成假阴性的结果。而对于重点科室用水，不正确检测方法会误导临床，给感染埋下隐患。 2、现行检测以PCA技术为主 目前，国际上缺乏医疗机构用水的微生物监测方法的统一标准。我国现行的医疗机构用水的微生物检测是执行GB/T 5750.12-2006《生活饮用水检验方法微生物指标》规定的菌落总数检测方法，即水样在营养琼脂上有氧条件下36℃±1℃培养48h后，所得的细菌菌落总数。检样的接种技术指定为倾注培养法。 3、GB 15982标准增加薄膜过滤技术 GB 15982-2012《医院消毒卫生标准》除了上述接种方法外还规定，将剩余放入内镜冲洗采样液，在无菌条件下采用滤膜（0.45μm）过滤浓缩，将滤膜接种于凝固的营养琼脂平板上，置36℃±1℃温箱，培养48h。这样将大大提高水源性微生物的检出率。 4、YY 0572标准引入R2A技术 YY 0572-2015《血液透析及相关治疗用水》对透析用水的微生物实验要求，应采用常规的微生物检测方法（倾注平板法、涂布平板法、薄膜过滤法）获得细菌总数（标准培养皿计数），薄膜过滤法是首选的检测方法，但不接受接种环法。可以参考采用《中华人民共和国药典（二部）》（2010年版）中规定的方法；或培养基宜选用胰化蛋白胨葡萄糖培养基（TGEA）、R2A或其他确认能提供相同结果的培养基，不能使用血琼脂培养基和巧克力琼脂培养基，推荐17℃～23℃的培养温度和168h（7d）的培养时间。由此可见，该行业标准已经从水体中异养菌的生长特点，采用贫营养型异养菌适用的培养基。而该行业标准的2005年版，则指定胰蛋白酶大豆琼脂或等价物，以倾注平板法的接种方式，35℃～37℃培养48h，来获得细菌总数计数；而薄膜过滤法结合低营养琼脂培养基R2A、28℃～32℃、培养5d或更长时间，还只是推荐的方法。 5、欧美国家已采用R2A技术替代PCA 欧美国家的供水行业从本世纪初开始，逐步采用R2A这种贫营养培养基，代替PCA培养基用于水中细菌的检测，所规定异养菌总数上限也因为培养基和培养条件的改变而做了相应的调整（见表1）。从允许异养菌数值对比来看，似乎欧洲标准比我国高出5倍，但是只要了解各自的培养基与培养条件，对水体中异养菌检测的覆盖性与敏感性，尤其是根据城市饮用水处理特点来制定微生物检测的策略，我们就会发现欧洲的检测方法更科学、更严谨，其对城市生活饮用水的微生物指标的控制更严格。 表1 我国与欧洲饮用水微生物检测与标准对比
大量的实验研究表明，水中贫营养型的异养菌，接种到富营养型的培养基上，反而不适应，不表现出生长，人们也就无法见到可视的菌落，也导致假阴性的结果。而R2A贫营养配方正好迎合了饮用水中的贫营养型异养菌的生长条件，因此，同样的水样在R2A培养基上生长的细菌种类、数量明显多于或高于PCA培养基。 主要参考文献 1.Reasoner DJ, Geldreich EE, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49: 1-7. 2.Byrd JJ, Xu HS, Colwell RR, Viable but nonculturable bacteria in drinking water[J].Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57: 875-8. 3. 白晓慧，吴汉靓，王海亮，等. 饮用水中异养菌平板计数检测方法的比较[J].净水技术，2004,26（5）：65-67. 4. 顾孔珍，线纯，罗岳平，用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率[J].净水技术，2004,23（1）：42-44. 5. Williams MM,Armbruster CR,Arduino MJ, Plumbing of hospital premises is a reservoir for opportunistically pathogenic microorganisms: a review[J].Biofouling, 2013, 29: 147-62. 6. 李文明，李伟英，陆辉，等. 供水管网水样R2A培养基细菌总数测定及其影响因素探究[J].净水技术，2014,33（6）：66-70. 7. 李珏，洪利娅，王知坚，等. 制药用水微生物限度检查新方法的研究[J].药物分析杂志，2014,34（2）：376-379. 8. Capelletti RV, Moraes ÂM, Waterborne microorganisms and biofilms related to hospital infections: strategies for prevention and control in healthcare facilities[J].J Water Health, 2016, 14: 52-67. 9. Safiri S, Ayubi E, Pseudomonas aeruginosa Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit Attributed to Hospital Tap Water: Methodological and Statistical Issues to Avoid Misinterpretation[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38: 1126-1127. 10. Bédard E, Laferrière C, Déziel E et al. Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buildings[J].PLoS ONE, 2018, 13: e0199429. |
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