在医疗机构中，几乎所有的医疗活动都离不开水。预防与控制水源性病原微生物的传播，是医院感染管理的重要任务之一。 在上一期的内容中，倪教授提到平板计数琼脂（Plate count agar，PCA）是用于检测饮用水中异养菌计数（Heterotrophic plate count，HPC）最常用的培养基。 但从上个世纪80年代以来，国外有大量研究表明，常用PCA技术用于水中微生物污染的检测可能严重低估了异养菌的真实数量。依据PCA计数结果来评价饮用水微生物指标，水路管网的清洗消毒效果可能并不完整，饮用水的微生物污染程度可能超出了人们的预期。是什么原因导致HPC检测结果偏低呢？本期讲座为您揭晓……
HPC检测结果偏低的原因 1、培养基环境不适应于异养菌的生长 PCA等一些高营养型培养基仅适用于营养要求高、且生长快速的异养菌。但这类细菌在水样细菌种类中仅占很小的一部分。而较大一部分的细菌因不适应于高营养、中温度（37℃）和短时间培养（48h），那些贫营养型的异养菌无法在设定时间内生长繁殖，形成肉眼可视的菌落。 2、细菌的“活而不长”现象 一些细菌，包括气单胞菌（Aeromonas）、埃希氏菌（Eschericha）、弯曲杆菌（Campylobacter）等被证实存在“活而不长” （Viable but non-culturable state，VBNC）现象，在PCA培养基不能形成菌落，但采用显微镜技术证实其活着。大量实验研究表明，当一些细菌处于不利生长条件的环境中，如含有化学消毒剂的环境，便表现出“休眠”状态，称之为细菌的VBNC现象。但是，一旦环境生长条件符合其生长繁殖，便恢复生长的能力，且依旧保留毒性的能力。人为设计让VBNC状态下的细菌恢复生长的环境（专用的培养基、培养条件以及培养设备等），是当前微生物实验的一项难题。 3、微生物生长的选择性 PCA培养基是最常用的异养菌检测培养基，但不是万能培养基配方，并不适用于所有的异养菌的生长条件。因为细菌的生理、生化特征的多样性，从而也决定了每种培养基使用的局限性，无法将水中的所有异养菌培养与分离出来。仅靠一个配方将水体中异养菌其一网打尽，这只是个美好的设想。因此，要想在临床实践中高效检测出目标细菌，应使用选择性培养基与设定的培养条件。 4、样本预处理对结果的影响 PCA技术是细菌生长在培养基中形成菌落，通过人工或设备自动计数来计算样品中异养菌的数量。在日常的实验中，倾注培养前应对送检样品进行预处理，如震荡、吸管吹打等操作，使样品中聚合的细菌的 “菌团”打散，以单个细菌与培养基混合，形成一个“克隆”菌落。如果这个步骤不到位，菌落的形成是建立在“菌团”的基础上，这样必然会导致细菌总数被低估的结果。 5、热冲击的作用 倾注培养的方法是，将检样先滴加至无菌培养皿中，再将融化的培养基冷却至45℃左右，倾注15mL～20mL，并与检样进行充分融合。由此可见，检样中的细菌需承受一次“热冲击”的挑战，一些损伤较重的细菌可能承受不了这一打击，而无法恢复其生长繁殖的功能，导致检样中细菌真实数量的减少。尤其是实验人员操作不规范，培养基的温度可能会更高，剂量也会倾注得更多，细菌所受到的“热冲击”作用会更强烈，其结果就可想而知了。 6、消毒剂的缺陷 消毒不充分可以使细菌处于亚致死的受损状态。另外，当细菌处于生物膜的保护，或被有机物或无机颗粒物包裹，细菌就可以躲避与消毒剂的接触，消毒剂也无法有效发挥杀灭作用。由于饮用水的化学消毒，考虑到对人体健康，以及氯消毒所产生的有害副产物、衍生物等，所使用的消毒剂浓度往往是受到严格控制的。当那些结构或代谢功能受损的细菌进入医疗机构的供水系统，在通过“漫长”的旅行，得到充分的“修生养息”。特别要注意的事，城市供水管网末梢水中的余氯浓度较出厂时下降了90%（0.05mg/L），此时为受损的细菌得以恢复生长提供了有利的条件。 7、其他因素 环境温度、水体中可生物降解有机物的含量、管网水流速度、水体的浊度、管路材质和表面光滑度、温度、pH值，以及长期处于滞留状态等因素均可以影响水体中微生物的存活与繁殖。 主要参考文献 1.Reasoner DJ, Geldreich EE, A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water[J]. Appl. Environ. Microbiol., 1985, 49: 1-7. 2.Byrd JJ, Xu HS, Colwell RR, Viable but nonculturable bacteria in drinking water[J].Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57: 875-8. 3. 白晓慧，吴汉靓，王海亮，等. 饮用水中异养菌平板计数检测方法的比较[J].净水技术，2004,26（5）：65-67. 4. 顾孔珍，线纯，罗岳平，用R2A培养基提高饮用水中细菌总数检出率[J].净水技术，2004,23（1）：42-44. 5. Williams MM,Armbruster CR,Arduino MJ, Plumbing of hospital premises is a reservoir for opportunistically pathogenic microorganisms: a review[J].Biofouling, 2013, 29: 147-62. 6. 李文明，李伟英，陆辉，等. 供水管网水样R2A培养基细菌总数测定及其影响因素探究[J].净水技术，2014,33（6）：66-70. 7. 李珏，洪利娅，王知坚，等. 制药用水微生物限度检查新方法的研究[J].药物分析杂志，2014,34（2）：376-379. 8. Capelletti RV, Moraes ÂM, Waterborne microorganisms and biofilms related to hospital infections: strategies for prevention and control in healthcare facilities[J].J Water Health, 2016, 14: 52-67. 9. Safiri S, Ayubi E, Pseudomonas aeruginosa Outbreak in a Neonatal Intensive Care Unit Attributed to Hospital Tap Water: Methodological and Statistical Issues to Avoid Misinterpretation[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2017, 38: 1126-1127. 10. Bédard E, Laferrière C, Déziel E et al. Impact of stagnation and sampling volume on water microbial quality monitoring in large buildings[J].PLoS ONE, 2018, 13: e0199429. |
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