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体外诊断网(www.iivd.net)，微光前行！本文来源：中华检验医学杂志, 2018,41(8) : 567-570.
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry, MALDI－TOF MS)作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。任何新兴技术应用于临床都需要建立规范的质量保证体系，以确保检测质量。本专家共识将对开展MALDI－TOF MS用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与能力评估、MALDI－TOF MS病原体鉴定过程的质量控制、检验程序性能验证等进行建议。
设施与安全要求
1．风险评估：
拟开展MALDI－TOF MS病原体检测的实验室需在风险评估基础上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。
2．安全防护：
任何操作临床病原体样本或病原体的实验活动至少需要在二级生物安全实验室(BSL－2)中进行。MALDI－TOF MS应安置在二级生物安全实验室内，同时使用MALDI－TOF MS检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要注意化学试剂的潜在风险。
人员培训与能力评估
各实验室应具备MALDI－TOF MS检测过程中涉及的所有操作人员的初次培训和定期能力评估的程序文件，对涉及的所有操作人员应进行初次和定期(至少6个月一次)的培训以及能力评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或实验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。此外，还应采用一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进行人员比对和/或考核，以确保所有操作者鉴定结果的一致性。通过培训，要求每位操作人员对每种病原体的鉴定结果必须达到本实验室设定的每种病原体的最小结果阈值。保存所有培训、考核和能力评估记录。
建议1 对于临床常见细菌(非高致病)，操作人员的个人防护应按标准预防要求，其病原体分离培养、蛋白提取及靶板点样时应在生物安全柜内进行，点样后的靶板转移至MALDI－TOF MS，分析过程中也需注意生物安全防护；对潜在的含生物危害二类及以上的高致病病原体如布鲁菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌等的临床样本，实验室人员应请示医院感染管理部门并尽量避免培养检测，必要情况下需要在生物安全柜内采用经灭活程序灭活后再进行质谱分析。
建议2 前期的样本处理过程中将会使用一些有机溶剂如乙醇、甲酸、乙腈、三氟乙酸和基质液等，这些溶剂具有腐蚀性或可燃性，可引起人体皮肤黏膜腐蚀、呼吸及循环系统功能紊乱、多脏器损伤，因此在实验的过程中使用此类有机溶剂试剂时建议有一个良好的通风环境，同时需加强操作人员的呼吸道、皮肤黏膜尤其是眼面部的个人防护。
MALDI－TOF MS
病原体鉴定过程的质量保证
质量保证可确保MALDI－TOF MS病原体鉴定结果的准确性和及时性，其内容涵盖分析前、分析中和分析后。
(一)分析前
1．菌株准备：
所有菌株均采用新鲜培养(16～48 h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代两次后使用。
2．靶板点样：
先将质控菌株/蛋白标准品点在靶板相应孔位，再点待测菌落。点样时应注意菌量适当、厚度均匀，不可带有琼脂成分。
3．加基质液：
点样后加入基质液，应自然凉干。
4．特殊病原体：
如分枝杆菌、丝状真菌和诺卡菌等需要通过蛋白提取法进行提取前处理，包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂耗材。详细处理过程建议参考制造商提供的SOP进行操作。
5．样本准备注意事项：
(1)靶板点样加入基质液后，需完全干燥形成结晶方可进行检测。(2)靶板准备完成后，如为细菌或酵母菌，需在48 h内完成检测；如为分枝杆菌，需在4 h内完成检测；如曲霉菌等丝状真菌，需立刻完成检测。
(二)分析中
一般情况下，MALDI－TOF MS检测可以得到以下几种鉴定结果：(1)高置信的鉴定结果；(2)多个鉴定结果，且每个结果的置信度相似；(3)无鉴定结果。
1．结果判断：
当MALDI－TOF MS提供了高置信的结果时，无需对图谱进行检查和复核；而当出现多个鉴定结果或无鉴定时，可能出现以下问题：(1)低质量的图谱导致无鉴定结果：需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及具体操作环节；(2)图谱质量较好而不符合预期的鉴定、多个鉴定结果或者无鉴定结果：应检查样本是否分纯、是否污染或数据库不包含待检菌种。
2．结果阈值：
目前MALDI－TOF MS的结果阈值通常分为两种：一种以置信度为阈值，置信度>90%的单一结果为优质鉴定结果，60%～90%且具有多个鉴定结果为低分辨结果(需要补充实验进行分类)，<60%为不能鉴定；另一种则以分值为阈值，质谱评分>2分(9.5分)的结果可以鉴定到种，1.7至2.0分(9.0～9.5分)之间可以鉴定到属(需要补充实验进行分类)，<1.7分(9.0分)为不能鉴定或可能鉴定到属。
(三)分析后
1．结果复核：
鉴定结果的复核是分析后质量管理的重要组成部分，是保证检验结果准确的一个重要环节。MALDI－TOF MS鉴定结果为以下病原体时，需通过相应的补充实验进行进一步鉴别。
2．仪器维护及保养：
按照制造商要求定期进行维护及保养。
3．化学试剂：
必须使用仪器制造商要求纯度的化学试剂。
质量控制
(一)室内质控
建议3 需血清学试验确认的病原体：大肠埃希菌(疑似志贺菌属和大肠埃希菌O157)、沙门菌属等；需要其他确认试验进行鉴定的病原体：烟曲霉复合群、黄曲霉复合群、肺炎链球菌和缓症链球菌群等；需要测序鉴定或报告到群：蜡样芽孢杆菌复合群、洋葱伯克霍尔德菌复合群、鼻疽伯克霍尔德菌和类鼻疽伯克霍尔德菌、无色杆菌属、弗劳地柠檬酸杆菌复合群和阴沟肠杆菌复合群等。
实验室需按照MALDI－TOF MS制造商的推荐及相关管理指南制定质控程序。按照制造商要求评估质量分析器、相关系统(软件和数据库)、化学试剂、靶板和用户的操作(靶板点样、有条件时萃取)。
1．质控菌株：
质控阳性对照菌株种类应根据实验室拟开展的鉴定病原体范围进行选择，质控菌株可采用制造商建议的标准菌株或经实验室测序等方法确认的临床菌株。所有质控阳性对照菌株进行质控操作时需采用新鲜培养(16～48 h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代两次后使用。
2．质控操作及频率：
按照制造商的SOP文件要求，在靶板清洗、基质溶液及标准品溶液配制后需每次进行阴性及阳性对照的质量控制，每次病原体鉴定时亦应如此。
3．仪器校准：
检测前仪器需进行自身校准，校准通过后方可进行后续鉴定。
4．阳性对照：
使用大肠埃希菌标准菌株(ATCC8739)鉴定分值必须达到制造商要求；如使用标准蛋白测试品，在分子量大于12 000以上的区域必须出现校准峰，应明确检测到m/z 13 683和16 952两个峰，确保高分子量端的准确性。
5．阴性对照：
检测结果应为"No peak found"或者"无鉴定结果"。阴性对照需使用空白试剂，用于排除可能由试剂污染或重复性靶板(阴性对照应为任意孔位)清洗不当造成的假阳性结果。
当质控结果失控或校准未通过时，应从各环节分析原因并予以纠正。常见原因包括：质控菌株/蛋白标准品污染、使用错误的质控菌株/蛋白标准品、使用错误的试剂、操作人员的操作失误等。记录分析失控原因并归档。
如果未发现上述明显的原因可重复测定质控菌株/蛋白标准品，结果在控，可直接进行后续检测；若不能纠正，应联系制造商采取相应的措施。
(二)室间质评
建议4 其他质控菌株(标准菌株或经验证的临床菌株)，包括革兰阴性杆菌(建议采用产气肠杆菌)、革兰阳性球菌(建议采用粪肠球菌)和念珠菌(建议采用光滑念珠菌)。
室间质评：全程参加由组织方提供的室间质评计划。当出现室间质评不符时，及时找到失控原因并纠正。保存每次室间质评信息，包括结果反馈、纠正措施等。无第三方组织的室间质评计划时，实验室应定期自行组织与其他实验室同类检测方法的室间比对。
检验程序性能验证
MALDI－TOF MS性能验证包括准确度和精密度。通过MALDI－TOF MS和现用方法或参考方法(如测序方法)获得的病原体鉴定结果进行比较以实现准确度验证。准确度验证尽可能包括临床菌株而不限于是质控菌株或标准菌株。精密度验证应包括所有主要可能存在的变量，如不同的培养基、培养条件和提取技术，通常用标准菌株或质控菌株进行精密度验证，应评估批内、批间，操作者之间以及连续几天的重复性或再现性。在适用的情况下，还应评估病原体MALDI－TOF MS与LIS或其他仪器系统之间接口的正常运行。
(一)适用范围
1．实验室引入SFDA批准的MALDI－TOF MS检测系统时，使用前应进行全面验证。
2．实验室使用MALDI－TOF MS时，若对病原体种类、试剂、数据库、分析软件和硬件等进行更换或升级以及扩大检测范围(即在原有检测病原谱基础上增加新的病原体)后，应进行部分验证。
建议5 性能验证符合要求后投入临床常规使用，在设备状态、环境、检测方法、人员等维持稳定的情况下，可采用文件和数据审核等定期评审分析系统状态，无需每年实施性能验证。
(二)验证方案
MALDI－TOF MS验证所用菌株按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或经参考方法确认的临床菌株，选择的菌种应尽量覆盖MALDI－TOF MS制造商公布的可鉴定菌谱，包括革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、厌氧菌、酵母菌、苛养菌、分枝杆菌等，同时还应覆盖验证本地区、本实验室以往检出的特殊病原体种类。
1．全面验证：
准确度：常见病原体如革兰阳性及阴性球菌、革兰阳性及阴性杆菌、酵母菌每种类别至少验证30株，厌氧菌、苛养菌、分枝杆菌(如开展)、丝状真菌(如开展)每种至少10株，并覆盖本地区、本实验室检出的重要病原体。比较MALDI－TOF MS鉴定结果与实验室现用方法或参考方法(如测序方法)之间的符合率。精密度：选择10株代表性菌株，每天重复检测3次，连续3 d。
2．部分验证：
见表1。
表1 常见情况下验证方案
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| | 准确度：选择10株以上该种类病原体，与现用方法或参考方法(如测序方法)比较精密度：1日内重复检测质控菌株3次 |
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设备重大修理 | | |
(三)可接受标准
严格按照制造商使用说明的要求进行结果判读(参考环节控制中的结果阈值)。
1．准确度要求：
验证的标准/质控菌株符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90%以上。
2．精密度要求：
菌株鉴定结果符合率应为100%。
若未能满足上述验证要求，则MALDI－TOF MS不能通过验证。制造商和/或使用者须采取相应措施，修正后的检测系统应再次进行验证。
以上专家共识内容仅限于MALDI－TOF MS用于临床病原体鉴定的质量保证要求，MALDI－TOF MS作为蛋白质组学研究的支柱技术，在医学及生命科学领域有更多的应用前景和价值，其他相关领域的应用的质量保证要求不包括在本次专家共识中。
编写组成员
编写组成员(排名按作者姓氏笔画排序)：上海交通大学医学院附属新华医院检验科(刘瑛)；上海交通大学医学院附属仁济医院检验科(李敏)；同济大学附属东方医院南院检验科(吴文娟)；上海交通大学附属儿童医院检验科(张泓)；上海交通大学附属第六医院检验科(汤瑾)；复旦大学附属中山医院临床微生物室(周春妹)；复旦大学附属华东医院检验科(赵虎、张艳梅)；复旦大学附属华山医院抗生素研究所(胡付品)；上海市临床检验中心(葛平)；上海交通大学医学院附属瑞金医院临床微生物科(倪语星)
来源：中华医学网
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