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[转帖] 细菌对杀菌剂的抗药性,感染预防界的新祸害?

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发表于 2019-2-19 08:17:33 | 显示全部楼层 |阅读模式
本帖最后由 川页 于 2019-2-19 08:30 编辑

细菌对杀菌剂的抗药性,感染预防界的新祸害?

露西·简·博克博士      伽玛卫生消毒专家
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“另一种可能的方法是,使用含有不同作用模式的多种杀菌成分组合的杀菌剂配方来降低微生物耐药的可能性,就像使用联合疗法来避免对抗生素的耐药一样。”
                                       –––––by Lucy Jane Bock
首批从使用杀菌剂(皮肤消毒剂和物表器械消毒剂)中获益的患者是两个男孩,1867年,约瑟夫·李斯特(Joseph Lister)描述了他如何用苯酚来防止两个男孩受伤的肢体感染,从而使他们免于截肢。1 从那时起,我们一直依赖于消毒剂,通过减少易感患者伤口、所使用用的导管、呼吸机和环境中的细菌污染来预防感染发生,易感患者如新生儿。如果杀菌剂失效,我们可能会再次活在一个充满更多危险的世界里,剖腹产、早产、侵入性手术、烧伤和意外事故等造成的死亡事件将在全球司空见惯。鉴于多重耐药(MDR)微生物可能导致无法治愈的感染,我们对杀菌剂的依赖再次增加,因为预防感染(使用杀菌剂)的实际效果优于治疗(使用失效的抗生素)。然而越来越多的证据表明,即使在推荐浓度下使用并且按照推荐接触时间使用杀菌剂,细菌也会对杀菌剂产生耐药性。从实验室研究中,我们也发现越来越多的证据表明微生物对抗生素具有交叉耐药性。我们正在研究这些令人担忧的结果,以了解观察性研究和实验室结果与临床感染预防措施之间的相关性,以及某些杀菌剂的使用是否会无意中导致出现对一线抗生素更具耐药性的细菌。
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杀菌剂用于患者和工作人员术前的手卫生、沐浴以及皮肤消毒,它们可帮助烧伤患者康复并防止易感患者被环境中的微生物污染所感染,如在新生儿病房里铜绿假单胞菌污染病人。2 虽然感染预防的措施取决于所用杀菌剂的效果,但检测杀菌剂效果的标准(EN 1040和EN 13727)并不非常具有挑战性,因为它们并不能非常准确地反映临床的污染。所需≥5的对数下降效果仅指减少悬液中浮游细胞的数量而没有考虑生物膜的保护,而且所用菌株为标准实验室菌株,不能准确地反映当前临床的多重耐药菌株。3-5在医疗机构中使用杀菌剂方面也没有统一的方案,相反,不同地方和国家的指导方针差别很大。有赖于大量商业证实有效的杀菌剂配方,我们才能将细菌菌落和表面污染降低到足以避免感染的水平。
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大多数杀菌剂在细菌细胞中有多个靶点,其中许多靶点尚未明确定义。通过改变细胞膜的强度或电荷使细胞膜破裂,导致跨膜质子泵失活、渗漏、最终裂解。在细胞内,杀菌剂可以通过破坏代谢过程或凝固细胞成分和破坏DNA发挥作用。6研究表明,杀菌剂的配方不一定总能达到足够的杀灭效果,至少在实验室环境中是如此,例如,肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌在氯己定和奥替尼啶的有效浓度下仍可存活50%,即使当分别暴露在推荐接触时间内,仍存在着感染预防失败的风险。7-8
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长期以来,人们知道某些微生物具有一种内在能力,能够在某些杀菌剂的推荐浓度下依然耐药的作用(见图1)。微生物对特定杀菌剂的固有抗性来自于它们的膜结构(革兰氏阴性菌)、外排泵的表达(如铜绿假单胞菌)或代谢状态(产生孢子)对杀菌过程产生影响。革兰氏阴性菌是多重耐药(MDR)最大的挑战。由于具有外膜和脂多糖(LPS)层,它们对杀菌剂渗透的敏感性不如革兰氏阳性菌。斯氏普罗维登菌(Providencia stuartii ) 和变形杆菌(Proteus spp. )具有特别高的杀菌剂耐药性。9此外,一些革兰氏阴性菌,如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和洋葱伯克霍尔德菌,含有大量的外排泵,有助于降低细胞内杀菌剂的浓度。10事实上,由受污染的消毒溶液引起的新生儿和儿科病房暴发经常报道,例如,在新生儿重症监护病房由受污染的氯己定溶液引起的洋葱伯克霍尔德菌的暴发11和在儿科肿瘤血液科暴发的无色杆菌暴发可追溯到受污染的季铵盐溶液。12细菌孢子对最常用的杀菌剂如氯己定和碘制剂具有天然耐药性,需要使用对其具有杀菌活性的消毒剂,例如高浓度的氯。13天然耐药的细菌最值得关注,我们正在通过对这些耐药菌可能隐藏的环境使用合适的感染预防措施来控制其传播。例如,建议避免使用氯己定冲洗导管,因为这虽然能杀灭革兰氏阳性细菌,但可能造成具有内在耐药性的奇异变形杆菌的选择性耐药,它可能形成结晶和生物膜,导致导管堵塞进而加重临床症状。14
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(图一)  根据微生物对杀菌剂的抗性进行分类。
革兰氏阴性菌对阳离子杀菌剂的耐药在院内MDR感染中提出了一个特殊的挑战。在实验室中已被证明能够耐药某些高浓度杀菌剂的菌群以粗体突出显示。
长期以来,人们认为敏感的细菌不能适应杀菌剂从而增加它们对高浓度杀菌剂的耐药性,理由是杀菌剂攻击细胞的多个非特异性靶点(三氯生是一个例外,因为后来发现它有一个特异性靶点FabI),15 现在已经证明这是不正确的。细菌能够改变它们的膜结构,上调外排泵和/或增加它们生成生物膜的能力从而实现对杀菌剂6的耐药 (见图2)。原本对杀菌剂敏感的细菌可能现在能够适应杀菌剂并可能通过消毒程序而存活,这令人担忧,也增加了管理难度。剂量不足的杀菌剂将使一些细菌克隆通过一个或多个抗性机制选择,对杀菌剂更具耐药性,从而保留生物活性。16-17 在实验室中发现,杀菌剂剂量不足可导致生物膜的形成,如污染情况严重、清洁不到位、稀释浓度错误、接触时间的不足、不正确的配方等。细菌对杀菌剂的适应有不同的机制也因不同的细菌有不同的适应情况。
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导致微生物对杀菌剂耐药性增加的另一个主要适应性是外排泵的上调(见下图2A),这使细菌可以将细胞内杀菌剂的浓度降低到亚毒性水平。在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中,所有5个主要的外排泵家族的成员都显示出对杀菌剂暴露反应的上调,从而导致对三氯生、氯己定、苯扎氯铵、双胍、西曲溴铵、多种季铵盐QACs、酚醛和其他物质的耐药性增加。9  通过qacA/B射流系统研究了金黄色葡萄球菌对氯己定的耐药性,尤其令人担忧的是,这些qac基因已经在含有抗生素和/或重金属耐药基因的质粒上被发现,这意味着对杀菌剂耐药的选择压力可以导致对抗生素耐药菌株的选择,反之亦然。20  SME-(Serratia marcescens粘质沙雷氏菌酶)型碳青霉烯类也被证明存在于遗传基因中,该遗传基因还包含TetR MFS外排泵,该泵可能增加对杀菌剂的耐药性,这是抗生素耐药性的共同选择和杀菌剂耐药性增加的另一个例子。21
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伤口或临床设备上已形成的生物膜,也对杀菌剂的起效产生障碍。生物膜很难被清除,因为这些细胞聚集在一起并受到作为扩散屏障的排出的细胞外基质的保护,并中和或结合杀菌剂使其失效。生物膜内的生理异质性也可以增强细菌的信号传递和基因交换,在混合物种的生物膜中,更耐药的细菌可以保护敏感的细菌22(见下图2B)。然而,除了现有生物膜提供的外层保护外,研究还表明,暴露于低水平的杀菌剂可增加生物膜本身的形成,例如表皮葡萄球菌中的案例23,这意味着暴露在残留的生物杀菌剂中可能会增加生物膜产生的可能性,从而增加去污失败的可能性。
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(图2)最常见的耐药性杀菌剂耐药机制
(A)革兰氏阴性菌,阳离子杀菌剂与带负电荷的脂多糖结合并穿透细胞膜。此外,通道蛋白使杀菌剂扩散到外膜。在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌,任何进入细胞的杀菌剂都会通过各种排出泵排出。更高的杀菌剂浓度可以使得排出系统不足以维持细胞内的杀菌剂处于亚毒性浓度。在耐药杀菌剂的细胞中,由于外排物的增多可进一步上调外排泵的表达,这将有助于细胞内维持杀菌剂的亚毒性水平。在革兰氏阴性细胞中,杀菌剂进入细胞的可能性进一步降低,通过通道蛋白的缺失和对带负电荷的LPS脂多糖的修饰,使阳离子杀菌剂对外膜结合力、穿透力大大下降。甚至在不动杆菌中也检测到脂多糖的完全去除。18
(B) 生物膜通过限制杀菌剂从细胞外向内的渗透,在某些情况下降解杀菌剂,从而使细菌细胞在生物膜中受到保护,降低杀菌剂的功效。生物膜内的细胞会改变新陈代谢,通常会增加对杀菌剂的耐药性。药敏的细菌(如革兰氏阳性细菌)可以受到耐药微生物(如革兰氏阴性细菌)的保护,使两者得以生存。
拥有生物膜的细胞仅暴露在亚毒性水平的杀菌剂中,在选择压力下产生更具耐药性的细胞,使其重新定植于杀菌剂的靶向区域。暴露在亚毒性水平的杀菌剂中也能诱导细胞形成生物膜,从而形成对杀菌剂耐药性不断增加的恶性循环。
在同一菌株中,经常发现不止一种针对杀菌剂耐药的机制,导致细菌在消毒剂的常见杀菌浓度下产生耐药性。许多针对杀菌剂的不同耐药机制导致了对抗生素和/或其他杀菌剂的交叉耐药。虽然大多数抗生素都有特定的目标位点(一个例外是多粘菌素)大多数杀菌剂具有非特异性和多靶点,但外排泵的表达增加,其中大多数具有广泛的底物范围,可将细胞内抗生素或杀菌剂的浓度降低到亚毒性水平。24同样,通过调整细胞膜,可以防止杀菌剂和抗生素进入细菌细胞,导致细菌产生交叉抗性并存活(见图2)。25生物膜形成能力的提高将拮抗杀菌剂和抗生素的作用。在实验室的耐药性研究中发现了几个这种交叉抗性的例子。在一些病例中,铜绿假单胞菌对奥替尼啶的耐药导致对氨基糖苷类药敏性降低。8令人担忧的是,由于PhoPQ.17突变导致脂多糖发生变化,适应氯己定的肺炎支原体菌株可能对多粘菌素产生耐药性。
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在临床上很难找到明确的由杀菌剂耐药导致抗生素交叉耐药的证据,相反,抗生素耐药也可导致杀菌剂交叉耐药,其致病顺序难以确定。然而,铜绿假单胞菌对奥替尼啶的耐药在模拟的临床环境中与的实验室环境中产生了相同的突变,这首次表明,实验室的耐药可能反映了在医院排水槽中可能发生的情况8(Bock et al . 2019稿件编写中)。一些研究开始在纵向研究的基础上分析临床环境中细菌种群可能发生的变化。抗生素和大多数杀菌剂在20世纪50年代开始广泛使用。通过比较1917 - 1949年肺炎克雷伯菌株与现代菌株的耐药谱可知,现代菌株对三氯生、氯己定和多种季铵盐的耐药均有所增加。26
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英国一家医院在长达86年时间里,采用了氯己定进行病原微生物的去定植,随后改为奥替尼啶。金黄色葡萄球菌菌株对氯己定和奥替尼啶的耐药性随着消毒流程的演变而显著增加。与氯己定和氟喹诺酮有关的外排泵NorA和NorB的突变也随时间增加。27
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类似地,一项对澳大利亚医院19年间粪肠球菌对酒精的耐药性进行的研究显示,这段时间内屎肠球菌的耐药性增强了10倍。此时期正是酒精搓手在医院得到了推广的时间。
在大多数耐酒精菌株中发现了与耐溶剂相关的基因突变,并检测到屎肠球菌E. faecium的耐酒精序列类型发生了转变。28荷兰最近的一项研究也发现,6型序列(ST6)在单核细胞李斯特菌感染中所占比例有所上升。ST6菌株含有emrC质粒,该质粒编码苯扎氯铵、阿莫西林和庆大霉素外排泵。在食品加工业中季铵盐类、苯扎氯铵的使用可能无意中使单核细胞李斯特菌在选择压下产生的毒性更强、耐药性更强的ST6菌株。29
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这些流行病学研究,结合对耐药性机制的实验室调查,是进一步探讨我们的发现与临床相关性的起点。过去15年来,对杀菌剂耐药性的实验室研究有所增加。这些研究表明,在实验室中,大多数微生物可以对大多数阳离子杀菌剂产生一定程度的增强耐药性。因此,问题出现了:对杀菌剂耐药性的增强在临床上没有被作为一个问题提出,是因为我们没有寻找它因此没有发现它?还是因为我们一直把它归因于其他因素呢?先前描述的一些较长期的研究表明,我们的医院中的微生物对杀菌剂的耐药性正在逐渐提高。抗生素交叉耐药和抗生素共选择耐药之间的关系,是杀菌剂耐药中最令人担忧的部分,这些直到我们开始描述一些杀菌剂耐药机制时才变得明确起来。因此,交叉耐药、共选择和增加杀菌剂耐药性的临床实例缺乏,并不能证明这些不会发生,而正是由于缺乏对杀菌剂耐药机制的知识,此类研究才未能得以开展。
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了解对微生物现有杀菌剂浓度的耐药性在疫情控制中尤其重要。疫情暴发主要通过加强感染预防措施加以控制,包括强化杀菌剂的使用。30 – 32

由于没有对临床菌株进行杀菌剂药敏性检测,尚不清楚感染暴发菌株对杀菌剂耐药性的增强是否是感染预防崩溃的一个诱因,以及在暴发控制中使用的特定杀菌剂发挥了什么作用。筛选暴发菌株中对杀菌剂耐药性的机制可以防止无效杀菌剂的使用,从而使得暴发无法控制。一项对杀菌剂药敏试验的独立研究,调查了从儿科烧伤病房患者中分离出的铜绿假单胞菌对聚维定碘、氯己定和磺胺嘧啶银的耐药性。根据感染菌株的药敏性,改变局部处理方案,成功地消除了伤口内的铜绿假单胞菌。33另一种可能的方法是,使用含有不同作用模式的多种杀菌成分组合的杀菌剂配方来降低微生物耐药的可能性,就像使用联合疗法来避免对抗生素的耐药一样。
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关于这种“多成分组合型杀菌剂”的有效性的研究尚未进行,因此,支持这种杀菌剂会降低耐药机会的观点仍然占大多数。此外,还计划开展进一步研究,以调查特定的杀菌剂-生物组合是否更有效,或是否增加耐药的可能性,以便感染预防专业人员在制定特定微生物应用指南时正确选择。总的来说重点是要考虑:是否需要或能够改变感染预防具体措施,以防止将来出现杀菌剂耐药和对抗生素可能产生交叉耐药性的问题,就像抗生素管理有助于为未来保存抗生素资源那样。3
综上所述
研究表明,在大多数情况下,杀菌剂在预防感染方面是有效的,但如果使用不当,则可能会失效。在这种剂量不足的杀菌剂暴露之后,细菌可以通过对抗生素产生交叉耐药性的机制,或在某些情况下,通过位于相同移动元素上的杀菌剂和抗生素耐药性基因的共同选择,增强对常用杀菌剂的耐药性。到目前为止,大多数杀菌剂耐药的证据是基于实验室的发现,但有迹象表明这些可能与临床有关,这显然需要进一步研究。根据目前有限的发现,问题仍然是:是否以及何时改变目前使用杀菌剂的方式,以避免今后在预防感染方面出现问题。
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致谢:感谢J·马克·萨顿和马修·E·万德对手稿的批评反馈。
资助:作者没有从任何公共、商业或非盈利部门的资助机构宣布这项研究的具体资助。
免责声明:所表达的观点是作者的观点,不一定是英国公共卫生的观点。
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