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[循证译稿] 转帖:醇类手消毒剂使得屎肠球菌耐受性增加?你可能想多了

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发表于 2018-11-21 13:10:47 | 显示全部楼层 |阅读模式
醇类手消毒剂使得屎肠球菌耐受性增加?你可能想多了
发布日期:2018-11-16来源:SIFIC感染循证资讯发布人:陈小晓
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近日在SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE杂志上出现了一篇屎肠球菌对手消液耐受的文章,题名为“Increasingtolerance of hospital Enterococcus faecium to handwash alcohols”,即医院内(获得性)屎肠球菌对醇类消毒剂耐受性增加。文章从耐药性分析、临床模拟实验以及基因分型三个方面,层层推进来论证自己的观点。

文章很长,结果大致如下:

⊙作者拿到了从1997-2015年期间的139株VRE,对他们进行耐异丙醇情况分析,结果显示,在23%的浓度下作用5分钟,屎肠球菌们随着检出时间的推移,医院内屎肠球菌对异丙醇的耐受性提高。2009年以后的菌株,比起2004年之前的菌株,更耐醇类制剂。

⊙紧接着,作者建立了鼠屎肠球菌污染表面的传播模型。70%异丙醇擦拭不同菌株污染的物体表面,并将小鼠放入相应的污染环境中,实验结果表明,耐异丙醇的屎肠球菌残留浓度更高,且更容易在小鼠的胃肠道定植。

⊙对其中的129株屎肠球菌进行基因分型,不同年龄的屎肠球菌们逐渐显示出了耐异丙醇的特性。


一石激起千层浪,此文一出,各路神仙开始报道。




路透社: Superbugs now also becoming resistant to alcoholdisinfectants ——超级细菌现在对醇类消毒剂耐药啦!(叫你们别用那么多手消液)


                               
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这位名为kelland kate的作者首先提到了“newwave of superbugs”即超级细菌的新浪潮,突出原文中的主角VRE(vancomycin-resistant Enterococcus)是超级细菌,VRE可引起多部位感染,治疗困难、多重耐药。接着Kate顺着原文的思路,指出醇类消毒剂的手卫生是VRE的主要防控策略,过去20年醇类手消毒剂的使用量攀升了10倍之多,但与MRSA不同,VRE感染率并没有下降,这促使原作者团队对醇类消毒剂耐受进行探索。随后Kate陈述了原文的实验方法,还采访了原文的共同作者。相对于开头提到的新浪潮,后面的陈述中规中矩。


https://www.reuters.com/article/us-health-superbugs-alcohol/superbugs-now-also-becoming-resistant-to-alcohol-disinfectants-idUSKBN1KM5UD(Aug 1,2018), Accessed 4th Aug 2018


卫报:Bacteria becoming resistant to hospital disinfectants, warn scientists——科学家警告,对消毒剂细菌正变得耐受(科学家们快想想办法)


                               
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如果说kate从超级细菌的角度理解原文,那么卫报的NicolaDavis则是从消毒剂的角度开展分析。他认为医院需采取新的策略防治超级细菌,因为消毒剂的主要成分异丙醇已经让VRE形成耐受。他同样引用原文作者的话:如果你想要控制VRE,那么不仅仅依靠醇类消毒剂。然后Nicola也从原文中截取了一些证据来支持他的观点。


https://www.theguardian.com/society/2018/aug/01/bacteria-becoming-resistant-to-hospital-disinfectants-warn-scientists (Aug1, 2018), Accessed 4th Aug 2018

不止路透社和卫报,NBC和TheTimes等媒体也相继报道了此篇文章,内容大同小异,即宣扬超级细菌“耐受消毒剂”。


眼看各路媒体把画风强行带偏,有位大咖坐不住了,并发了一篇文在柳叶刀,名为“Enterococcusfaecium tolerance to isopropanol: from good science tomisinformation”即屎肠球菌耐受异丙醇:好的科普与误导信息。这篇文章的作者不是别人,正是大名鼎鼎的DidierPitter教授。


教授直言不讳:你很科学,但是不对(手消液不背这个锅)。


“这些故事(很可能是无意地)歪曲了研究分析,并暗示了以酒精为基础的消毒剂正在变得无效。”事实上,醇类手消毒剂是手卫生中最有效的制剂,提高了医务人员的手卫生依从性,是预防交叉感染的关键。


教授讲述了2个观点:

  • 原文说较新的菌株比较老的菌株对23%的醇类溶液更耐受。但目前医院使用的醇类制剂有效含量在60-90%,没有证据表明细菌在此浓度下产生抗性,23%的消毒剂耐受不具备临床意义。而且原文也写道当细菌暴露在70%异丙醇溶液下,细菌对数值下降无明显差异。因此,医院应使用高效的、经过验证的醇类手消毒剂,并鼓励良好的手卫生依从性,降低医院感染和细菌耐药的比率。

  • 原文中讲到耐醇类消毒剂的屎肠球菌比不耐醇类的菌株传播更迅速。其实医院的环境物表消毒是一套综合的方法,而不仅是快速的擦拭。讲到底,醇类本身也不推荐用于环境物表的VRE污染防控。



教授表示,好的研究常常成为曲解的受害者,如果媒体一味的吸引眼球,则造成弊大于利。Didier Pitter教授最后强调,醇类手消毒剂在WHO基本药物清单上,每年拯救全世界数百万人的生命。


https://www.thelancet.com/journals/laninf/article/PIIS1473-3099(18)30542-5/fulltext


看到这里,大家心里有点谱了,屎肠球菌对异丙醇耐受,手消液可不背锅


综上看来,目前的争论主要在于文章的立意方面。小编认为,文章的立意可能是主导了舆论走向,但瑕不掩瑜,该文设计新颖、时间跨度长(菌株1997-2015)、实验方法多样(耐受试验、定植模型、全基因测序)。


我们就来近距离欣赏一下Sacha J.Pldot的这一篇Increasing tolerance of hospital Enterococcus faecium to handwash alcohols



医院内(获得性)屎肠球菌对醇类手消毒剂耐受性增加



作者:第一作者是澳大利亚墨尔本大学,Peter Doherty感染和免疫学研究所,微生物学和免疫学部门,Sacha J.Pldot, Wei Gao等人


摘要


尽管使用醇类手消限制了mrsa和屎肠球菌等病原微生物的传播,但屎肠球菌引起的医院感染仍在增加。作者对1997年-2015年的139例屎肠球菌(E. faecium)菌株进行醇类耐受性检测,发现2010年后的菌株比2010年前的菌株耐受性增加10倍。使用小鼠胃肠道定植模型(mouse gut colonization model)模拟屎肠球菌传播,展示耐醇类屎肠球菌可抵抗70%异丙醇标准溶液的消毒,并导致小鼠胃肠道定植增加(与醇类敏感菌株相比)。作者查看细菌基因组特征变化,耐醇类E. faecium在涉及碳水化合物摄取和代谢的基因中积累了突变,突变形成证实了这些基因在E. faecium耐受异丙醇中的作用。


简介


屎肠球菌引起的院内感染特点:感染率高(全球约10%)、治疗困难(天然耐药+获得性耐药)、存交叉感染风险。


基因层面:E. faecium种群分析揭示了快速进化的谱系Clade-A1,包括克隆复合物CC17,该种系包含了导致横跨5大洲院内感染的菌株。这些菌株对氨苄西林、氨基糖苷类和喹诺酮类耐药,并且菌株基因含有大量可动遗传因子(转座子),富含编码改变的碳水化合物利用和转运蛋白的基因,可区分社区感染和非致病菌株。


澳大利亚一项最近的调查显示:E.faecium所致感染占细菌性肠球菌感染1/3,其中90%是耐氨苄西林的CC17菌株,这些菌株的50%耐万古霉素(VRE)。控制和治疗VRE相当困难。


醇类消毒剂是全球范围感染控制策略主要(支柱)措施,醇类消毒剂的使用与耐药菌(尤其MRSA)医院感染率下降相关。常规的手消含70%异丙醇和9-11%的乙醇,使用手消揉搓30s可减少3.5 log10的细菌总数,被认为有效。手消中的醇类有效浓度可产生快速杀菌作用。醇类耐受现象已在一些细菌属中出现过。


为了控制VRE,许多医院对所有病人开展主动筛查,并采取接触隔离,包括使用隔离衣、手套和定植者单间隔离,这些措施既贵又繁琐。由于VRE毒性相对较低,除个别高危险性科室如血液科和ICU进行全面筛查,其他科室只需采取标准预防和酒精类洗手液搓洗为主。在澳洲的两家教学医院Austin Health和 MonashMedical Centre,病人入院时进行直肠VRE定植筛查,高危险性科室的所有病人每周进行筛查。VRE定植病人隔离在同一地点,并常规进行接触隔离(包括严格遵守醇类手卫生指南)。在此,近期作者调查了139例分离的E.faecium对手消液中的异丙醇的耐受性。


结果


1.随着时间的推移,医院内E.faecium对异丙醇的耐受性提高


醇类手消在2002年12月被系统地引入Austin Health医院和 MonashMedical Centre医院。这一实践改变的一个后果是,医疗机构使用的醇类手消数量大幅增加。例如,奥斯丁健康中心和莫纳什医疗中心使用的含酒精的洗手液从2001年的每月100升增加到2015年的每月1000升。


作者验证了假设,即屎肠球菌分离株适应这一变化环境,与早前(2004年以前)分离株相比,它对醇类的耐受性更强。作者进行了一项酒精杀灭试验,在23% (体积比v/v)异丙醇下暴露5分钟,因为这种浓度和时间提供了一个区分E. faecium分离株的动态范围。结果从初始的108 CFU减少了log10。


作者评估了19年时间内从澳大利亚两家大医院收集的139株屎肠球菌的异丙醇耐受性。异丙醇耐受性存在较大差异,菌株间差异为4.7 log10 CFU。且差异与E. faecium基因型无关(表S1)。他们称后期分离株比早期分离株更易耐受异丙醇的杀灭(图1A),在比较2004年以前和2009年以后的分离株时,群体平均耐受差异显著(0.97 log10平均差异,P < 0.0001;图1 a)。E. faecium种群中存在遗传多样性,有两种主要的CC17多位点序列分型(MLST), ST17和ST203,每一种都逐渐显示出异丙醇耐受性的增加(图1,B和C)。代表最近出现的克隆(2012年ST796)的分离株均表现出高度异丙醇耐受性(n = 16;中位数为减少1.14 log10;图1D和表S1)。34株万古霉素敏感E. faecium (VSE)菌株和28株万古霉素耐药E. faecium (VREfm)菌株获得性万古霉素耐药与异丙醇耐受性无相关性(Fisher 's exactly test, P = 0.738);表S1)。暴露于乙醇中的E. faecium分离株与暴露于异丙醇的表现出相似的耐受性,与其他优势E. faecium序列类型的代表相比,ST796菌株对乙醇的耐受性也更显著(P < 0.0002;图S1)。


                               
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▲ 图1:展示1997-2015屎肠球菌对异丙醇的耐受性逐渐提高(A);和三个主要克隆ST17、ST203和ST796的耐受性提高(B-D)

2.屎肠球菌醇类耐受的临床意义(Clinical relevance)(详细介绍了小鼠模型)


为了评估23%异丙醇杀灭试验发现的酒精耐受性差异的临床意义,作者建立了鼠E. faecium的污染表面传播模型。用70%异丙醇擦拭2株VRE和2株VSE污染的表面,并比较干预效果。小鼠胃肠道中4株菌株定植剂量(CD50)无显著差异(图2A)。


作者选择了2012年的醇类耐受分离株(Ef_aus0233, 0.45 log10)和1998年的醇类不耐受分离株(Ef_aus0004,4.34 log10)。6只BALB/c小鼠,用万古霉素预处理7天,口服灌胃屎肠球菌菌株,剂量递减。各分离株定植数量(CD50)均较低,无显著差异(图. 2A, 左图)。接着用3×106CFU的各分离株对笼子内的地面进行涂擦,并为每个笼子制定消毒方案,即用70%异丙醇溶液或水进行擦拭。结果,异丙醇擦拭后的笼子地面细菌密度为0.4-30CFU/cm2,耐异丙醇的屎肠球菌,残留浓度较高。(图. 2B)


然后,将六只BALB/c小鼠各自放入笼内1小时后,单独分开安置7天,然后筛查胃肠道屎肠球菌定植。通过三个独立的实验,作者评估了每一个实验中被屎肠球菌定殖的老鼠的百分比。


实验表明,耐醇类菌株比醇类敏感菌株更能抵抗70%异丙醇消毒剂,并在小鼠肠道定植更多(P <0.01; 图. 2C, 左图)。


作者决定进一步验证醇类耐受性和传播假说,选择一对不同醇类耐受性的VSE分离株,这对菌株比EFSUA004和EFLA0023遗传一致性更佳,从而减少可能出现不同基因组的潜在混杂表型。VSE分离株(EFSUA02626和EFSUA099)仅共享的29个核心基因组单核苷酸多态性(SNP)差异,却有相反的醇类耐受表型(4.4倍差异) (表 S1 and S2)。每株分离株都有相同低的CD50

(Ef_aus0026,19CFU;95%CI, 9~41 CFU;而Ef_aus0099,12CFU;95% CI, 3~62 CFU(图2,A和B,右)。通过四个独立的实验,大量的小鼠被异丙醇耐受性的E. faecium分离株定植。



                               
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▲ 图2.异丙醇耐受屎肠球菌对消毒剂耐受

(A)2株VRE菌株(Ef_aus0004 andEf_aus0233)和VSE菌株(Ef_aus0026和 Ef_aus0099)的CD50(灰色虚线)

(B)屎肠球菌传播定量试验结果。70%异丙醇消毒前后和水清洗后表面的细菌浓度(CFU)

(C)小鼠接触上述表面后的胃肠道定植率(%),是3个以上独立实验的结果。


3.屎肠球菌分离株的种群结构


为寻找与醇类耐受相关的遗传适应的特征,作者首先比较了139株屎肠球菌分离株中129株的基因组(10个菌株未测序)。通过成对核心基因组比较和群体结构的贝叶斯分析(BAPS),推断出高分辨的基于SNP的进化过程,并将群体分层为七个不同的基因组,这与先前的MLST(多基因座顺序分型)命名一致(图3A和图S2A)。该种群有大量的泛基因组,包括8739个种间同源基因簇,突出了该E. faecium种群的广泛遗传多样性(图S3)。每个基因群的外观也有一个时序结构。从先前描述的2006年ST203替代ST17到2012年出现ST796,作者观察到屎肠球菌克隆在不同的时期进入医院,每个克隆表现出醇类耐受性增加(图1和图S2B)。

4.与醇类耐受相关的细菌遗传因子的鉴定


高醇类耐受性在不同的屎肠球菌谱系中均有所体现,提示了多基因现象导致了异丙醇耐受的发生(图3)。作者通过进化收敛分析找寻醇类耐受的基因学基础,识别E. faecium基因组中可能包含与醇类耐受性相关的基因或突变的区域。作者首先在129个分离株中识别出19对匹配的E.faecium菌株对,它们共享了不到1000个核心基因组SNP差异,但却显示了超过1.5倍的醇类耐受差异(图3A和表S2)。


然后,作者在至少三对分离株的相同染色体核苷酸位置和相同变化方向上搜索核心基因组突变(即同质异性体)。他们识别了400个至少有2对突变的核苷酸位点,75个有3对以上突变的位点,75个位点中仅3个是同向突变(图3B)。其中一个位点是rpoB基因,编码RNA聚合酶亚基。RpoB中的H46N/Y取代基与醇类耐受性降低有关(图3)。



                               
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▲ 图3.屎肠球菌分离株的种群结构

(A) 129株屎肠球菌分离株全基因测序和醇类耐受结果。用RAxML最大似然法推断谱系进化,基于18292个核心基因组SNP对Ef_aus0233菌株进行双序列比对。先前的MLST分型用序列型表示。每一对所选分类的对数差(log10)用热图(heatmap)展示,蓝色代表倍数小,红色代表倍数大。序列对前缀字母“A”和“M”表示Austin医院和Monash医学中心。

(B)系统进化匹配的屎肠球菌分离对中SNP差异收敛性分析。环形图代表Ef_aus0233菌株相关基因组的2,888,087个碱基对染色体,显示每对屎肠球菌核心基因组SNPs收敛位点。追踪ID由颜色编码键表示。3个同源突变(处于染色体位点519,608, 2,396,698, 和2,838,889)的核苷酸序列变化方向一致,并在3个以上屎肠球菌菌株对上做出高亮和注释。

(C)根据辅助基因组变异建立的DAPC模型,对醇类敏感(蓝色)和醇类耐受(红色)分离株进行概率分离

5.与醇类耐受相关的细菌基因因素的确定


为了验证预测的有效性(基于收敛分析和DAPC),研究人员使用等位基因交换,构建与醇类耐受ST796相关菌株Ef_aus0233的靶向突变体。



                               
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▲ 图4.屎肠球菌中与异丙醇耐受相关基因的功能确定

(A)  屎肠球菌质粒197-kb图,展示了与异丙醇耐受有关(蓝色)70-kb区域,还有2个糖PTS座子,包括被等位基因删除的6.3-kb的PTS-2位点(紫色)

(B)   519608碱基对位点附近区域结构图,展示了被等位基因删除的00501基因,编码假设存在的半乳糖苷转运体。深蓝色箭头指示了用于产生突变体结构重组底物的引物位置。

(C)   菌株暴露后生存的能力,是rpoBH486Y,197-kb质粒ΔPTS-2和Δ00501半乳糖苷同向转运突变的作用

(D)  rpoBH486Y突变、197-kb质粒ΔPTS-2和Δ00501半乳糖苷同向转运突变在3%异丙醇下生长表型相似。与野生型E. faecium相比,每个突变体在翻倍时间内的倍数变化。还描述了修复后的突变体相对于野生型E. faecium的表型。拒绝无效假设。


方法和讨论略。

以上即文章的主体部分。不难发现,该文的主要篇幅集中在基因层面,5个结果层层深入,循序渐进。作为一篇探讨消毒剂耐受的文章,能做到如此全面、深入,不仅展示了优秀的脑洞、扎实的专业知识和良好的团队协作关系,而且很好的诠释了“循证”的理念,这些都是值得国内学者学习的。


而媒体们虽然带偏了画风,但同时也把感染预防与控制工作呈现在大众面前,让群众知道该项工作的重要性。至于超级细菌究竟是否耐受消毒剂,相信读者已有了自己的答案。



发表于 2018-11-21 14:40:58 | 显示全部楼层
谢谢老师的分享,认真学习中!
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发表于 2018-11-21 15:33:27 | 显示全部楼层
学习了小白天使老师的资料分享!
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发表于 2018-11-21 15:41:35 | 显示全部楼层
努力学习,谢谢楼主的资料分享!
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 楼主| 发表于 2018-11-22 09:48:10 | 显示全部楼层
LZJDTQ 发表于 2018-11-21 14:40
谢谢老师的分享,认真学习中!

和老师一起学习。
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 楼主| 发表于 2018-11-22 09:49:13 | 显示全部楼层
川页 发表于 2018-11-21 15:41
努力学习,谢谢楼主的资料分享!

和川页老师一起学习。
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 楼主| 发表于 2018-11-22 09:50:20 | 显示全部楼层
lyluoxiuhua 发表于 2018-11-21 15:33
学习了小白天使老师的资料分享!

和老师共同学习。。。
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