宏基因组学:查明微生物身份新手段

细菌耐药

新闻背景：《美国医学会杂志》（JAMA）近期刊发了一篇题为《利用不需培养的宏基因组学测序技术研究产志贺毒素大肠杆菌O104∶H4暴发株》的研究论文，引起了学界和社会的广泛关注。这篇论文中应用了一种称为“宏基因组学”的技术方法，不通过培养，直接从病人样品中检测分析其携带的病原微生物，甚至可以发现用常规方法难以检出的病原菌。由此，大家都开始关注一个共同的话题，是不是已经找到了一个能够解决突发传染病疫情病原鉴定的金刚钻呢？是不是我们以后再也不会像面对当年SARS疫情那样手足无措呢？

■本报记者 王庆

病原检测技术的尴尬

众所周知，人类肌体发生感染，其根本原因都是被病原微生物侵入了人体器官或组织，直接或者间接造成对人体的伤害。世界上到底有多少种微生物，目前没有人能够明确这个数字。

江苏省人民医院检验科顾兵介绍：“人类对于微生物的认识与研究主要是建立在纯培养基础上，然而研究发现通过纯培养方法估计的环境微生物多样性不及总量的1%。”

“对于临床常规的细菌鉴定，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等，传统的实验室培养方法是可靠的。”顾兵说，但传统的培养方法也有一定局限性。

比如，有相当比例的病原菌是不可以培养的；再如，在2011年德国产志贺毒素大肠杆菌（STEC）O104∶H4暴发感染时，由于这是一个既往没有报道过的新的亚型，没有相应的诊断试剂可供进行临床检验，“这就使得该菌的鉴定非常困难”。

“现有的常规检测手段只能针对我们已知的病原微生物，对于未知病原，只能依靠一个长期、烦琐、严格的流程来进行判定。”北京基因组研究所技术研发中心常务副主任任鲁风说。

随着基因组学的发展，科学家发现，绝大多数微生物都以核酸（DNA或RNA）作为遗传物质，而且微生物的基因也具有其明确的种属特征，因此对核酸进行检测分析逐渐成为了微生物检测的金标准。在这一基础上，科研人员开始尝试利用宏基组学来检测微生物。

宏基因组学潜力足

宏基因组学（metagenomics）最早是在1998年由Handelsman等提出的，意思是指生境中全部微生物基因组的总和。

“简言之，宏基因组学研究的就是一个特定环境中所有微生物的核酸序列，分析这个环境中到底有哪些微生物存在，哪种微生物在这个环境中当老大，它们对这个环境以及相互之间有哪些交流和互动。”任鲁风说，“这个环境有可能是大兴安岭的一块黑土，也可能是南极的一片浮冰，当然也可能是某个发热病人的一口痰。”

宏基因组学研究的工作流程一般可以概括成，样品采集、核酸提取、大规模测序、数据比对检索分析、生物学功能分析等。

整个工作流程中，并没有对真正的研究对象（目标微生物）进行分离、纯化和培养富集，也就是说，这一研究手段并不在乎样品中有何种微生物，也不在乎有多少，而是只要在样品中，就统统把核酸序列测定出来，然后再通过和已有的核酸序列数据进行比对，判断已知种类和对未知种类进行预测。

这样的研究方法摒弃了此前对微生物的分析手段中对于可培养性的依赖。 “利用这一研究手段，可以不用采取成功率和效率低下的培养方法，就能获知病原的种类，对于感染性疾病的预防、控制、诊疗和预后都具有莫大的潜力。”任鲁风说。

也有瓶颈

几乎任何感染性疾病的诊疗，最关键的环节之一是明确病因。常规的检测技术包括定量PCR技术、基因芯片技术、酶联免疫技术、细菌生化检测技术，以及细菌培养技术等。

据任鲁风介绍，这些技术面临着检测目标单一、耗时长、操作复杂、需多种技术相互印证、只能针对已知目标等缺陷，当遇到危急状况或暴发性新突发疫情时，现有技术手段就很难满足时效性和精确性的要求。

“宏基因组学技术则能够满足这样的需求，应用这一技术可以一次性发现所有病原的存在状况，同时直接通过核酸序列进行判别，具有其他技术不可比拟的准确性优势。”任鲁风说，“如果能够将这样的诊断手段应用于临床实践，将极大提高对病原微生物的判明效率和准确率，以利于具有针对性的指导治疗。”

然而，这一技术的应用还面临着灵敏度、检测速度、操作性和经济性的瓶颈。

任鲁风举例说，宏基因组学研究中最麻烦的一点就是干扰数据的比例过高问题，80%~90%的数据都是相对无用的，相当于大海捞针，需要从海量数据中挖掘少得可怜的有效数据。

同时，整个分析过程包括了样品处理、核酸提取、建测序文库、高通量测序、数据分析等环节，检测速度和操作性目前还无法向基层应用进行普及，高通量测序的成本虽然已大幅降低，但仍然难以进入普通医疗市场。

任鲁风所在的项目组正在进行高通量测序技术进入临床诊疗的开发工作，采用的技术策略是将整个操作流程全自动化实现，利用具有专利技术的样品处理工艺，最大程度降低背景干扰，自动化操作可以有效实现标准化流程，降低人员要求，产出数据直接通过云计算中心进行标准化计算分析，直接将结果反馈至用户，从而满足灵敏度、速度和操作性问题。

另一方面，从事临床微生物检验多年的顾兵表示，客观地讲，不能因为宏基因组学的优势而否定传统的培养法，预计在未来一段时期内，培养仍然是主流的检验方法。

《中国科学报》 (2013-05-08 第5版 生物周刊)
http://news.sciencenet.cn/sbhtmlnews/2013/5/272684.shtm

细菌耐药

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“整个工作流程中，并没有对真正的研究对象（目标微生物）进行分离、纯化和培养富集，也就是说，这一研究手段并不在乎样品中有何种微生物，也不在乎有多少，而是只要在样品中，就统统把核酸序列测定出来，然后再通过和已有的核酸序列数据进行比对，判断已知种类和对未知种类进行预测。”

莲雾

比对分析是非常庞杂的工程，另外，样本的采集要求也较高。这项技术主要是用于微环境中所有微生物的检测。

细菌耐药

莲雾 发表于 2013-5-8 19:04

                               
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比对分析是非常庞杂的工程，另外，样本的采集要求也较高。这项技术主要是用于微环境中所有微生物的检测。

同意，但注意临床检验也是可以用的。比如，JAMA的这篇文献是分析的粪便标本。