生物膜及相关感染性疾病--台湾感控杂志

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生物膜及相关感染性疾病

李育霖1,2刘尊荣1,2黄美丽2  彰化基督教医院 1内科部感染科 2感染控制室

随着医学的进步，越来越多的管路及人工植入物被使用于医疗及改善人类的生活，当获得这些医疗辅助的益处时，一个不能避免且麻烦的问题便是感染。一但这些医材被细菌所感染，在这些无机物质的表面细菌会形成生物膜，而伴随而来的是困难的治疗以及高并发症或严重的后遗症。甚者必须将管路或人工植入物移除，使原本的医疗前功尽弃。而另外一些临床困难治疗的感染症，如：感染性心内膜炎、慢性骨髓炎、慢性摄护腺炎、甚至肺结核…等，近年来也发现生物膜的形成也在致病机转及治疗难度扮演着重要的角色。生物膜是近十年来对细菌感染研究的一个新的观念，我们的敌人不是一只一只的细菌，而是一整群细菌社群，在群体中每个细菌的个体会有基因的交换传递，会有整体基因的调控，甚是会有分工合作的情形来对抗外在加予的生存压力。虽然每一个细胞的个体都是单细胞生物，然而以社群方式的感染却有着类似多细胞生物的协同合作。本文从生物膜生成的机转到临床相关疾病，到最后治疗的应用作一说明。希望未来针对这样的感染机转能有更进一步的了解与研究，以其克服临床上生物膜所带来的困难。（感控杂志 2011:21:44-51）

前　言

生物膜 (biofilm) 广泛的存在在自然界中，是微生物存在在环境里的自 然状态。一开始是在环境或工业科学中被广泛的研究，如输送管线或管路的沾黏及阻塞所传送效率降低或环境

清洁的困难等。19 世纪以来，Robert Koch 在显微镜下发现微生物的存在并将其与临床感染性疾病的关系串连起来。后来发展出要确定感染成立所需符合的柯霍氏假说(Koch’s postulates)，其中必须从被感染个个体培养出致病菌而建立出微生物培养系统，而这套系统一直沿用至今且成为感染症医学发展的重要基础。然而为了要增加培养出来致病菌的机会，所以我们在培养基中提供最有利于细菌生长的环境，但是在现实的环境中资源是有限的，微生物也必须面对各种不同压力的挑战，如营养来源、温度、湿度甚至放射线…等。因此在资

源充裕且生长压力小的环境下所培养出来的细菌和在资源紧缩且生长压力大的环境下生长的相同细菌是否仍有一致的型态？体外培养的结果是否能代表或预测为生物在人体内的状态？1970 年代科学家 Chen 及 Costerton 使用穿透式电子显微镜观察细菌在不同条件下的生长，发现细菌从刚培养出来时和在增值几百倍后的菌落完全不同，而造成这样差异的正是生物膜的形成。之后数十年来随着分子医学知识的蓬勃发展，我们对生物膜有更多不同层次的了解，也发现其在许多人类的感染性疾病中所扮演的角色 [1,2]。除了外观的不同外，同一种微生物在两种截然不同的形态下表现出不同的生活模式，尤其是对外在环境压力的调节与适应。这样子的转变不只发生在环境中，临床的感染是病源与人体的互动，而病原菌在人体中必须面临到多方面的生长压力，如免疫力的攻击，抗生素的使用或甚至养分来源的缺乏，促使着微生物必须改变及调整生长的形态或甚至分工合作来取得更好的生存机会。

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以下我们一一的介绍包括生物膜形成的机转及操控的机制，为什么微生物选择以生物膜的方式存活在自然界中，微生物如何藉由生物膜的形成进行彼此的分工合作，和我们如何利用生物膜的概念设计及发展新的治疗微生物方法。
生物膜形成的机转
形成生物膜是微生物生存的策略，而迫使微生物形成生物膜的因素简单来说还是离不开达尔文的演化论，在生存受到威胁时所发展出来的一套适应方法，所有的演化目的均是为了延续生命，将基因传递下去。生物膜是一堆微生物形成的社群[3]，而成群的生长第一个最主要的目的便是为了抵御外在环境来的压力，譬如营养的缺乏、酸碱值、极端温度、或甚至是去污剂或抗生素所带来的威胁。

形成生物膜可以区分为几个步骤 [4,5]，第一步是附着，指的是微生物在无机或有机物表面上的黏附，成为接下来增殖的基础 (niche)。尤其处在固体-液体界面的交接处 (例如水或血)
更是适当的附着处。通常比较粗糙的表面、厌水的材质、增加流速 (剪力上升)、适宜的温度及附近营养来源充足会促使附着机会增加。除了环境里的物理和化学因素，微生物本身的特性也参予附着的机制，例如 Pseudomonas spp 的鞭毛、细菌的运动能力、分泌于外在的 DNA 及膜蛋白 (如 Staphylococcus aureus、capsular polysaccharide adhesin、staphylococcal
surface protein、autolysin)…等，对附着产生也扮演重要角色[6]。而一旦附着之后便会有不同的基因调控表现，如 Pseudomonas aeruginosa的 algC 基因在水流系统中产生附着几分钟后便会有加强表现的情形[7]，而这样的基因调控促使膜外多醣体 (exopolysaccharide) 的合成以利接下来生物膜形成[8,9]。附着之后第二步便是建立微生物社群 (microcolony)，此时重要的是个体间的黏着和累积 (accumulation)，而这一个步骤和细菌本身的特性有关，比如
Staphylococcus aureus的 polysaccharide intercellular adhesion (PIA)，poly-b(1,6)-N-Acetylglucosamine (PNAG) 是两个主要决定微生物个体间黏着的重要蛋白，而这些蛋白则受到 intercellular adhesion regulator (icaR)这段基因的调控。在附着与增殖累积后生物膜则会发展生 3D 的立体结构，外表则会包覆着多醣体，形成一稳定的结构。微生物在其中可以藉由数量感应等机制进行基因的交换或整体调控，而最后因应环境改变或特定
原因下微生物群体破体而出 (dispersal) [10,11]，再度成为单一自由营生的个体寻找下一个附着的目标，如此周而复始为生物膜的一个周期。而一般我们称自由营生的个体为浮游状态
(planktonic form)，而群聚生长的状态为生物膜或固着状态 (sessile form) (图一)。

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数量感应 (quorum sensing)
数量感应是是一个十分有趣的现象，有些人称数量感应为细菌沟通的语言，是微生物协调彼此基因表现所使用的工具[12-14]。一开始发现数量感应的现象是在 1970 年代对于 Vibrio fischeri这种海中的微生物的发光特性与细菌的密度成正相关的观察，简言之是微生物因应菌体数量密度的改变会产生基因表现调控的一种现象。整个数量感应的步骤分成四部分：(1) 由每一个个体微生物制造小分子传递物质 (2) 将此小分子释放至细胞周围环境 (3) 经由受器辨识这些在细胞周围的小分子物质，当超过一定浓度的阈值后 (4) 经由讯息的传导改变基因表现的操作 (如操作子)。
其中革兰氏阴性细菌是利用 Nacylhomoserine lactone (AHL)，而革兰氏阳性菌则是使用 autoinducing peptides (AIPs) 来作为传递的小分子，另外还有一些共通的小分子如 autoinducer-2。而经由数量感应来调控的基因包罗万象，比如像 P. aeruginosa用两套 lux type 系统来调控本身的毒力因子，分别是 las和 rhl (分别以所制造的蛋白 elastase 和 rhamnolipid 命名)，其中 las会影响 rhl系统促使许多毒力相关因子的调控增加，进而引起临床疾病。这样子的调控可以藉由将这两的基因利用分子生物技术突变掉后使毒力下降来证实，这样的 las和 rhl于 P. aeruginosa感染肺部囊肿性纤维化 (cystic fibosis) 的病患时，在痰液里面的菌体常可见这样的调控，所以在造成临床的相关疾病扮演重要的角色。另外革兰氏阳性菌的 S. aureus则使用 agr locus 调控 RNAII (负责编码 agrB, agrD, agrC，和 agrA) 及 RNAIII 来抑制细胞壁相关的蛋白产生及使分泌性的毒力相关蛋白产出增加，以因应较拥挤的群体密度，协调往外扩展空间争取养分而非在原地不断增生后耗竭。藉由细胞壁
的黏着因子产生的生物膜在人体先产生移生现象，而黏着后的增生及数量调控后所产生的毒力因子进一步地造成侵入与散布，而最终成为临床感染性疾病。

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临床影响及相关的感染症
美国 CDC 曾估计，超过 65% 以上的感染症疾病和生物膜有关，而生物膜的形成为的是在不同的压力下创造适合生长的环境，跟临床感染症的发生有极大关系，也对临床治疗也会
造成影响，增加对抗生素的抗药性及规避免疫系统所带来的挑战。
(一) 生物膜相关的临床感染症
许多的临床感染症都和生物膜的产生有相关，而其中最为典型且有代表性的不外乎是感染性心内膜炎、导管相关的血流或泌尿道感染、人工植入物的感染、牙周病、尿路结石感染及摄护腺炎[15,16]。这一些疾病的共同特征是治疗不易，常需要比一般感染症更长的抗生素治疗时间，或是必须借助手术的方式移除病灶。举例来说在导管相关的血流感染中， Staphylococcus epidermidis是一个麻烦的菌种，因为临床上是否为致病源的判读不易，有可能是培养产生的污染，但也有可能是致病菌[17,18]，而控制 S. epidermidis形成生物膜的操作子是 icaADBC，其中有 icaA、icaB、 icaC、icaD 和 icaR 等基因群，所负责控制的则是在前文提到 PIA 和 PNAG的形成，和细菌的聚集增殖有关。有人把是否含有 ica 基因群和是否为临床有意义菌株做比对，发现 85% 从血瓶培养出来有临床意义的菌株带有 ica
基因群，而只有 6% 从皮肤取得的移生菌株含有 ica 基因群。因此可见生物膜的形成和细菌侵入人体有关，而且这样的特性可以反过来当作侵入性疾病的指标。
(二) 增加抗生素的抗药性
过去我们总是希望能用体外的实验结果预测体内的治疗效果，但是我们也观察到提高细菌培养数量时，其最低抑菌浓度 (minimum inhibitory concentration, MIC) 也会相对的提高，我们称之为数量效应 (inoculum size effect)。除了数量的不同外，我们把培养在 planktonic 状态和 sessile 状态的同一只细菌作比较，也能发现 MIC的不同，所以除了量外，在大量细菌
存在的情形下透过生物膜的形成，数量感应的基因调控后也会发生的质的改变，而这样子的变化对抗生素的治疗效果是不利的。因为生物膜形成而对抗生素产生抗药性有几种机制，包
括 (1) 降低或减少抗生素的穿透 (2) 因生物膜所造成的抗生素浓度差使部分细胞生长数度减换或停止继续分裂 (3)对外在的压力所产生的调适 (基因表现改变) (4) 小部分细胞变成高度保护的静止子 (persister)[19]。
(三) 规避体内免疫系统的攻击
除了对抗生素所产生的抗药性外，被生物膜保护的菌体也能有效的规避免疫系统的攻击。可能透过的机转如下：(1) 限制白血球侵入菌体， (2) 透过数量感应使基因调控改变来适应免疫挑战，(3) 降低白血球的吞噬能力，(4) 减轻白血球产物的作用力如自由基等。在一较早的动物实验模型中也证实将不同型态的同种细菌加上淋巴球做刺激，可以发现到生物膜型态
的细菌比浮游型态的细菌产生较少的 interferon-gamma，甚至生物膜型态产生的量跟没加细菌的差别不大，成功的躲过对免疫系统的刺激与反应 [20]。
治疗策略
随着我们对于生物膜的机转及临床重要性与影响的了解越来越多，许多针对生物膜所发展出来的疗法应运而生，以下分成化学性治疗及物理性

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治疗来介绍：
(一) 化学性治疗
化学性的治疗指的是药物的治疗，第一个要考虑的还是我们一直在使用的抗生素，因为我们将细菌培养在生物膜的固着状态，因此在测试细菌的抗药性时，除了原本的最低抑菌浓度之外，有一相对应的名词为最低生物膜清除浓度 (minimum biofilm eradication concentration; MBEC)，等同是要能清除生物膜状态细菌的最低抑菌浓度。最低生物膜清除浓度的数值常常远高于最低抑菌浓度，甚至是临床达不到的数字，然而测量这样的一个临床似乎没用的数字还是能给我们在选择药物时参考。在生物膜状态下一样都是升高的 MIC，若我们知道哪
些药物升高的比例较低，或许用来治疗的成功率会提高。另外也可以用来测试两种或以上抗生素联合使用时的评估工具，看是否能藉由协同作用增进对生物膜感染症的治疗。
除了传统的药物之外，针对生物膜形成机制或因应而生的抵抗力所设计的药物或许是将来我们能寄望的目标。在动物实验上发现透过抑制数量感应的胜月太 (RNAIII-inhibiting peptide;
RIP) 注射可以有效抑制细菌在体内生物膜的形成，进一步增加抗生素的治疗效果，改善临床病情[21]。
(二) 物理性治疗
物理性的治疗是非药物的，第一能做的当然还是直接移除感染的病灶，然而通常生物膜相关的感染都是比较深部或人工植入物相关的感染，要第一时间移除感染源或清创往往会囿于临床条件的阻碍，而近年来随着材料科学的日新月异，藉由改善材料材质或制程来避免细菌的沾附的进展一日千里。比如说镀银的气管内管，藉由释放出的银离子阻碍生物膜形成，被证实能部分下降插管后院内感染肺炎的机率。另外一些奈米科技制成的金属表面也能有效的减低细菌的沾黏且不影响正常细胞的亲和性。在一个以兔子腿骨设计的骨髓炎动物模型中，对患部通以微量的电流也能有效的下降感染部位的细菌数量[22]。低频且低功率的超音波也在诊断与治疗生物膜疾病上有所帮助，经过超音波处理过的检体可使细菌的检出率上升，且在治疗上超音波能使处理过的生物膜对于抗生素的感受性提高 [23]。
结　论
生物膜是是近十几年来发展出来，对细菌的行为研究的新兴理论。而随着我们对整个机转的逐渐了解，也有越来越多的证据证实其和临床感染症的相关。一些临床不容易处理的临床感染症，或我们不愿意见到的医疗并发症常带给临床医师极大的困扰。而运用生物膜关念所设计的治疗或预防是未来我们应持续关心及注意的领域，冀望能有突破性的发展来改
善病人的预后。

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参考文献

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无云

先加入收藏，之后认真学习。谢谢分享

pll

正需要生物膜的资料，准备搞个口腔诊疗用水的调查，及时雨，谢谢老师的分享！

老虎5188

谢谢老师，收藏学习。。

大漠驼铃声

这个要学习补充下自己哦。谢谢分享！