【感染科普笔记2024-4-9】刘永安丨mNGS/tNGS在感染性疾病检测应用中的规范化、差异化
本帖最后由 高山雪莲W 于 2024-9-26 16:03 编辑讲者丨刘永安（瑞金医院）
整理丨邹林（佛山市第二人民医院）
审核丨秦海燕（昆明市第一人民医院）
来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会
感染性疾病是人类死亡的重要原因。常规检测病原体手段包括染色镜检、分离培养、血清学和PCR等等。但是部分感染性疾病患者通过常规手段检测最终未有病原学依据，其中包括40%不明原因发热患者、55%脑膜炎患者、50%菌血症患者、30%肺炎患者。临床对病原体的检测提出更高的需求，希望快速出具检测结果，病原体广覆盖，结果精准。mNGS与tNGS技术是随着临床的需求而产生。今天我们将跟着刘永安教授学习如何运用这两种技术，更好的服务患者，让患者获益。
一、mNGS/tNGS临床应用规范化（一）mNGS介绍1.宏基因组二代测序(Metagenomic next generation sequencing)：利用高通量测序技术分析样品中全部微生物组成。中国食品药品检定研究院体外诊断试剂所组织开展了病原宏基因组高通量测序(mNGS)检测试剂质量评价联合研究显示：（1）mNGS对病毒、结核、真菌、非结核分枝杆菌的检出效能不均衡，影响检出率的可能原因包括：报告遗漏、生物信息学分析问题、未检出对应病原体序列。（2）mNGS对阴性标本报告精确度不足其可能原因主要有三个方面：
①以序列数为参考的定量效果或修正方法不够完善；②缺乏定植微生物的致病荷载阈值和致病条件；③对于呼吸道不同微生物的判读标准结构化程度不足。
（3）提高mNGS检出率的思路：①应用前，使用种类充分的参考品做好的性能检测；②检测中，严格把关阴性阳性对照及关键参数，采用可靠的自动化流程；③检测后，需要良好的判读原则与方法。
2.mNGS室间质评2020年全国下呼吸道感染宏基因组测序室间质量评价预研活动结果报告：DNA室间质评项目参评单位合格率为44.4%(40/90)。
2022年全国下呼吸道感染宏基因组(DNA和RNA)高通量测序室间质量评价预研活动结果报告：DNA+RNA室间质评项目参评单位合格率为41.8%(51/122)。
室间质评合格率低的原因分析：检测流程差异性较大，是否去除宿主核酸微生物核酸抽提效率，报告解读能力不足，数据库的构建，解读人员的专业化
（二）tNGS介绍1.靶向基因测序技术(Target next-generation sequenc ting,tNGS)：通过大量针对特定基因序列的引物对待测样品中抽提出的核酸进行超多重PCR扩增，获得大量目标核酸片段，对这些目标核酸片段进行高通量测序，然后对所得序列进行生信分析。
2.tNGS在分枝杆菌病诊断中的应用专家共识（1）靶向测序适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM病的诊断及鉴别诊断，也适用于菌量丰富的临床标本或菌株的耐药基因突变检测，或用于分枝杆菌耐药的诊断。（2）靶向测序检测的适宜送检人群及时机：疑似肺结核患者、疑似结核性胸膜炎患者、疑似肺外结核患者，复治结核患者、疑似NTM病的患者。（3）靶向测序阳性阈值设定原则及判断标准：由于靶向测序采用的是扩增分枝杆菌多靶点分类基因的方法，判断标准不同于mNGS检测。特异性序列>100条序列，且非单一靶点序列，可推荐作为阳性阈值判定标准；特异性数据<100条序列，特别是同批次有获得大量序列数支持结核病诊断的标本时，需行其他方法学进行佐证，可进行实时荧光定量PCR确认。
备注：特异性数据<10条序列时，尤当慎重判读，建议考虑另留取一份样本进行检测以佐证本次检测结果。如重复样本获得阳性结果，无论序列数如何，都应首先考虑其结核病诊断，如果复测结果为阴性，则暂不考虑其结核病诊断。
二、mNGS与tNGS差异化发展（一）mNGS与tNGS技术特点1.宏基因组测序(mNGS)：大海撒网(应有尽有)，tNGS是mNGS技术的重要补充；靶向测序(tNGS)：人工鱼塘撒网(全是鱼)，检测成本更低检出即为常见病原体。tNGS靶标选择思路：国内外标杆性研究文献，权威数据库，临床需求调研，mNGS病原数据积累，靶标病原，耐药基因，毒力基因。病原靶向测序(tNGS)原则：最大的满足临床需求，科学的检测病原设计，精准的临床信息解读。
2.mNGS与tNGS检测病原效能评估（1）国外研究结果：灵敏度/检测限、精度和交叉反应性：mNGS和tNGS对细菌、真菌和病毒的检测范围相当。交叉反应性：添加1x105CFU/ml高浓度的偶发分枝杆菌标本中，mNGS和tNGS检测都报告为结核分枝杆菌。方法学性能：tNGS流程的总体准确性为65.6%(95%置信区间为59.2%至71.5%)，阳性预测值(PPA)为45.9%和阴性预测值(NPA)为85.7%。mNGS流程的总体准确性为67.1%(95%置信区间为60.9至72.9%)，PPA为56.6%，NPA为77.2%。国外研究结论：①tNGS流程：需要更多的时间和试剂来制备文库，但简化了生物信息学分析。②mNGS流程：检测流程上要求较低，但需要复杂的生物信息学分析。（2）国内研究结果：tNGS在呼吸道病原微生物检测方面的效能与mNGS相当。
3.tNGS检测优势（1）有效降低的检测成本：tNGS样本测序数据量较低，只需要针对特异性片段进行检测，降低检测成本。（2）大幅强化表型基因检测性能：针对耐药、毒力够基因进行扩增，可满足针对病原体特定基因的检测需求。（3）进一步提升靶标病原检测灵敏度：对靶序列进行扩增，提升检测灵敏度。（4）不受人类基因组及背景菌影响：检测目标仅包含预先设定的致病病原体，完全不会受到人源干扰及背景菌群的影响（5）对病原体进行定量检测：可以通过简单的引入定量内参，实现对病原体的真实定量检测，获得样品中每个被检出病原体的真实拷贝数。
4.tNGS检测不足（1）Panel中病原引物设计难度大，引物间相互干扰无法完全避免；（2）检测靶标有限，只能针对 panel中的病原进行检测，无法检测罕见、新发的病原；（3）存在较大的污染可能性依赖于数据算法剔除；（4）针对呼吸道等开放性腔系样本无法获取微生态信息。
（二）mNGS与tNGS检测靶标差异
[*]宏基因组测序(mNGS)：细菌14385种，真菌738种，RNA病毒3902种，DNA病毒7598种，寄生虫128种，支原体/衣原体136种，分枝杆菌1125种。27,000物种的病原数据库，包括罕见，新发的病原，耐药基因包括2850种。
[*]靶向测序（tNGS）：205种病原体：真菌30种，细菌70种，DNA病毒20种，RNA病毒47种，分枝杆菌10种，寄生虫5种，其他23种。86种耐药基因：氨基糖苷类、大环内酯类、林可酰胺类、磺胺类、多肽类、喹诺酮类、青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、四环素类耐药基因。38种毒力基因：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等。
（三）mNGS与tNGS适用范围差异
[*]危急重感染、不明原因感染和反复治疗效果不佳的患者采用tNGS或mNGS。
[*]常规中、危重感染：常见的病原体如肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌等感染，采用靶向tNGS检测，灵敏度高、耗时短性价比高，满足常规门诊和住院患者需求。
[*]轻度感染：培养、镜检、qPCR/RT-qPCR等常规检测手段便可迅速锁定病原，对症下药，满足大部分常规门急诊患者需求。
（四）mNGS与tNGS检测费用差异
[*]mNGS的技术核心是高通量检测技术，tNGS的核心是超多重的PCR技术，相较mNGS，tNGS较低的检测成本。
[*]测序量差异：mNGS 20M；tNGS 0.03～0.06M。
[*]mNGS的检测费用为中千水平，tNGS的检测费用可降低到小千的水平。
（五）mNGS与tNGS总结
（六）mNGS与tNGS应用展望
[*]适用范围：mNGS主要应用于怀疑感染的急危重症、常规检测阴性但怀疑感染的疑难杂症的患者。tNGS主要应用于感染初筛、非特殊病原菌感染者，动态监测感染治疗效果的患者。
[*]技术范围：自动化流程以及准确且更快速的测序仪(如：全自动一体化系统测序仪的诞生，自动化微生物生物信息分析流程等)。mNGS：针对不同样本采用高效且快速的去除人源核酸方法，提高真菌、难破壁病原的检出；测序仪器及试剂国产化，进一步降低测序成本。tNGS：自动化引物设计系统的研发，可有效降低tNGS的技术难点。
[*]应用范围：mNGS和tNGS都需要进一步明确临床使用场景，并根据临床应用场景明确检测样本类型，目标病原范围，阳性判断值，以及产品配套使用的数据库，未来基于传统检测、tNGS和mNGS的小、中、大覆盖范围的病原检测方法将更有效、更精准的服务于临床的精准诊疗。
三、典型案例分享（一）案例信息
[*]基本信息：男，79岁，长期“阿尔茨海默症”，“垂体瘤”微创术后9年，“胆囊炎”病史半年。入院诊断：（1）呼吸心跳骤停，心肺复苏术后；（2）呼吸道梗阻；（3）昏迷缺血缺氧脑病；（4）吸入性肺炎；（5）胆囊结石伴肌囊炎；（6）阿尔茨海默病；（7）脑梗死后遗症。
[*]病例特点：老年男性；神志昏迷，气管插管，机械通气，起病急，病程长，长期住院，反复发热，院内感染高危人群。感染指标：超敏C反应蛋白波动范围1.3～76.05(参考值0～6)；降钙素原波动范围，0.02～0.327(参考值<0.046)，发热时升高。
[*]多次进行痰培养及mNGS对比发现：培养结果显示，肺炎克雷伯菌(KPN)每次体外培养易检出。mNGS提示的检出菌序列数，KPN有时少于其他菌，但是每次也均可检出。体外培养，每次均可检出耐碳青霉烯类KPN(CR-KP)为KPC酶型；mNGS多次检出KPN，未提示耐药基因 KPC。
痰液病原情况对比（同一时间采集标本mNGS与tNGS对比）
痰液耐药基因检出情况对比：mNGS 耐药无检出，tNGS检出如下
注：mNGS耐药基因是基因组层面“广撒网”，病原本身含量的拷贝数及病原在微生物的占比有很大关系。tNGS的耐药基因是在专门设计针对性的引物“抓取”。
[*]总结此病例mNGS与tNGS结果思考（1）与mNGS相比，tNGS可提高检出靶向库中覆盖的、mNGS由于占比少，可能漏检的病原体。例如本病例中mNGS未提示的粪肠球菌和鸟肠球菌。（2）与mNGS相比，tNGS绝对漏检未覆盖的病原体，例如本病例中tNGS漏检的新洋葱伯克霍尔德菌，tNGS的数据库选择很重要。新洋葱伯克霍尔德菌最近院内检出占比逐年升高，已逐渐超过洋葱伯克霍尔德菌。因此，panel的维护更新很重要。（3）与mNGS相比，tNGS对耐药基因的富集，可大大提高耐药基因的检出率。
小 结刘永安教授详细介绍了mNGS与tNGS两种技术的特点，差异以及临床适用范围。通过学习，指导临床医生在工作中根据患者的实际情况合理的选择mNGS或tNGS，让患者最大程度的获益！欢迎投稿：sific2007@163.com“本平台所有文章欢迎大家转发到朋友圈、群内学习，但若需转载至公众号或其它平台发布，请先联系小编确认同意”封面图片来自视觉中国官网图文：王小虾
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