【感染科普笔记2023-11-28】探秘病原微生物专栏丨艰难拟梭菌的艰难之旅
作者：刘焱超/温海楠（承德医学院附属医院）审核：宁永忠（北京垂杨柳医院）
“叮铃铃铃铃！”一阵急促的电话声叫醒了我这个刚刚独立值班的小帅哥。“您好，急诊检验室，请问有什么问题？”“您好，我这里是重症医学科，我科有位患者怀疑是艰难梭菌感染，请问检验科微生物室都可以做哪些检查？”一位听起来年龄不大的医生询问道。
“什么菌？老师，我没听清”
“艰难梭菌，导致腹泻的！”
“老师，您稍等下，我是新来的，我问一下其他老师”
放下电话，我赶紧叫醒了我的带教老师，他先是给临床回复电话，之后给我讲了艰难梭菌的相关知识，咱们实验室能做哪些检测。我听得一知半解，下了班，回家打开电脑开始了对这种细菌的了解之路......
一、什么是艰难梭菌？
艰难梭菌（Clostridium difficile）又名难辨梭状芽孢杆菌。现在属名调整为拟梭菌属，所以菌名更名为艰难拟梭菌（Clostridioides difficile）。在国内因为“艰难梭菌”这个名字沿用已久，且各位学者对其接受程度较高，故本文依然用“艰难梭菌”这个名字。
它属于厌氧革兰阳性芽孢杆菌，因其对氧极为敏感，很难常规分离培养而得名。它对高温、紫外线、干燥、电离辐射和多种化学物质有很强的耐受性，可在体外存活数月以上。该菌首次发现于1935年，直到1977年研究者才发现本菌与长期使用抗生素引起的伪膜性肠炎有关。尤其是克林霉素的广泛应用，其后该菌在全球范围内，特别是发达国家中分离较多。在美国，每年有250,000例腹泻是由艰难梭菌引起的，造成每年超10亿美元的损失。
艰难梭菌在正常人体肠道内可少量定植，分离率在健康人群粪便中约为3%～5%，健康新生儿中约为30%，长期卧床的患者中为20%～30%。有研究显示，399位入院时艰难梭菌培养阴性的患者，21%会在住院期间获得艰难梭菌，其中63%为无症状携带者，剩下的37%会发生腹泻。近年来，我国北京、广州等地均报道有艰难梭菌感染病例，腹泻患者艰难梭菌检出阳性率为15%～40%。国内于2017年发布了我国艰难梭菌诊治专家共识，2018发布了诊治指南，2020年中国台湾对相关指南进行了更新。从51篇亚洲VDI文献分析，我们可以发现我国艰难梭菌感染现况与欧美国家类似，但是我国的临床医务人员对艰难梭菌的认识可能有限。
二、艰难梭菌的致病性
艰难梭菌主要经粪-口途径传播，产毒素艰难梭菌过度繁殖导致肠道菌群失调并释放毒素，导致抗生素相关性腹泻和伪膜性肠炎等疾病。高毒力株（如RT027型）会产生暴发性流行，能够引起低年龄组、无基础疾病患者甚至是门诊患者的感染，引起巨结肠、大肠破裂，通常会伴有生命危险。有证据表明，使用氟喹诺酮类抗生素可能在这类感染中起关键作用。
以下人群更容易感染艰难梭菌：1.老年患者；2.住院时间长；3.患严重基础疾病；4.长期使用广谱抗生素；5.使用质子泵抑制剂或其他抑酸剂的患者；6.免疫受损状态（包括恶性肿瘤和器官移植）等。
艰难梭菌通过产生毒素而致病，主要毒素为毒素A（TcdA）、毒素B（TcdB）和二元毒素，分别受各自编码的基因调控，不是所有艰难梭菌都有编码毒素的基因，一些高产毒菌株产生的二元毒素，使艰难梭菌毒素A 、B的毒力增强，从而使症状加重，毒素C（TcdC）对毒素A 、B 的表达具有负向调节作用。
三、艰难梭菌的实验室检查
艰难梭菌感染（Clostridium Difficile Infection, CDI）是一种需多种检测才可以确诊的疾病，目前没有单个实验可以作为CDI的确诊实验。而在高毒力株（如RT027型）出现后，临床医生又迫切需要一个明确的CDI诊断。临床上常用的诊断方法主要分为两类：1.检测粪便中的毒素A和毒素B；2.检测菌体。
（一）标本送检
用于艰难梭菌培养和毒素检测的标本应该为新鲜的粪便标本(理想的水样便体积为10~20 ml，至少为5.0ml或5g)。为了减少从定植患者中获得阳性培养结果的概率，仅需要对腹泻患者进行检测。大便拭子标本因为量少而不能用于毒素检测。标本必须在密闭、不渗漏的塑料或玻璃容器中运送。粪便标本必须在2h内送检。如果需要保存，那么粪便必须储存在厌氧环境(厌氧转运瓶或者转运袋)。在4℃冰箱放置不超过2天。做毒素检测的标本可在4℃保存3天，如果不能马上检测，就必须冻在-70℃。
（二）临床标本中艰难梭菌检测方法
[*]厌氧培养：它是两种主要诊断标准之一，优点是可以进行后续的分子分型和流行病学研究，缺点是从粪便中培养复苏艰难梭菌的方法不能评估毒性，因此培养方法经常要结合毒素检测。
[*]谷氨酸脱氢酶（GDH）抗原检测：GDH是所有艰难梭菌（包括产毒株和非产毒株）都高水平表达的代谢酶，所以当检测阳性时必须要结合毒素检测方法。在核酸扩增实验（NAATs）广泛应用之前，许多实验室将GDH检测分成两步法，对GDH阳性标本进行毒素检测，而GDH阴性标本则判定为艰难梭菌阴性。GDH检测阳性但毒素检测阴性的患者可考虑是非产毒株定植。因为GDH的NPV高，所以可以用于初步检测。文献证据如下：与产毒培养和细胞毒素中和试验（cell cytotoxin neutralization assay，CCNA）比较，其NPV高达98.4%～100%，至今最大的一项CDI诊断研究项目的最新数据也证实了这点(相对于产毒培养和细胞毒素方法的NPV值分别为99.5%和99.8%)。
[*]艰难梭菌毒素检测方法：虽然还没有一致认可的标准方法，但长期以来CCNA被认为是艰难梭菌毒素检测的重要标准之一。CCNA方法需要将粪便过滤后接种到单层合适的细胞系，37℃孵育24～48h后观察细胞病变。可以用的细胞系有包皮成纤维细胞、Vero细胞、MRC-5肺成纤维细胞及其他医学细胞系。一旦出现细胞病变，就需要用索德里梭菌或者艰难梭菌的抗血清中和试验评估细胞病变的特异性。方法的局限性是需要做中和试验和较长的检测周期。
[*]核酸扩增方法：2009年，美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准了第一个核酸扩增方法。目前有12个技术平台和检测技术方法获批，采用了不同的技术方法，包括PCR、环等温扩增技术和微阵列技术。与GDH分析相似，NAATs的NPV和分析临床灵敏性很高，但是特异性和阳性预测值(positive predictive value, PPVs)值得担忧。在Dubberke等的研究中，当用临床参数评估方法的效果时，NAATs的特异性在所有诊断方法中最低。部分原因是测试标本分类不合适，因为被检患者中36%没有腹泻症状，20%用过通便剂。而且，在英国一项超大规模前瞻性多中心研究中，作者发现NAAT阳性但CCNA 阴性与病死率和住院时间延长不相关。同时，该文献作者认为NAATs方法会导致CDI过度诊断，他们建议NAATs方法可以用于第一阶段来排除艰难梭菌，然后用更特异的毒素检测来识别那些最可能感染艰难梭菌的患者。
[*]毒素免疫法诊断CDI：很多商品化的酶免疫测定方法（EIAs）可用于艰难梭菌毒素的检测。这些方法用包埋在横向免疫层析膜或者微孔固相设备中的单克隆或多克隆抗体单独检测毒素A或者同时检测毒素A和B。毒素检测的结果就代表标本毒素阳性或者阴性，与TcdA和TcdB结果没有区别。EIAs 检测CD 毒素的优点是特异性高( >90%) ，能区分产毒株和非产毒株，并且检测周期短，数小时即可出结果，操作简便，应用广泛；缺点是敏感度较低( 39%～76%) ，不能单独用于CD 感染的实验室诊断。目前，EIAs检测CD毒素常和GDH检测或NAAT联合应用，用于CD 感染实验室两步法或三步法诊断。
总的来说，很多诊断检测方法都可用于艰难梭菌疾病的诊断。什么方法最恰当仍存争议，但是基于GDH检测的初步结果，接着进行灵敏的毒素检测或NAAT检测的多步推断方案是目前的最实用选择。EIAs用于毒素检测缺乏敏感度和特异度。CCNA 阳性结果与严重患者症状的符合率最好。不管使用什么方法，只检测具有相应临床症状的患者可提高诊断准确性。产毒培养对流行病学研究仍然有用。
四、艰难梭菌感染的治疗
发生艰难梭菌感染时应尽快停用高风险抗生素，药物治疗选择甲硝唑或万古霉素口服，其他治疗包括预防脱水、益生菌、粪菌移植等，具体疗程及剂量须由医生依据患者的情况进行评估。
五、艰难梭菌的预防
艰难梭菌感染防控相关研究显示，美国部分医院通过合理的感控措施，在不到两年的时间内将艰难梭菌感染降低了20%；英国通过推广感控策略以及抗菌药物合理使用，3年内将艰难梭菌感染降低了一半以上。由此可见，艰难梭菌感染是可控的。首先我们要做的是主动对高风险人群进行CD的筛查；其次，对于CDI的患者科室应该及时进行隔离，做到专人专物，医护离开隔离病房必须用流动的水进行手卫生；再次，对于CDI患者使用后物品的消杀应做到提高浓度，有报道表明环境中使用的含氯消毒剂浓度应提高到2000～5000mg/L；最后，要做到发现疑似暴发的情况要及时上报，万不可拖延大意。
小 结
在过去的十年中，CDI成为最有害的医院感染之一。最重要的是要记住，预防CDI从医疗卫生专业教育开始，包括洗手、戴手套、医疗器械和患者环境的适当消毒，以及最佳的抗生素管理。接受抗生素治疗的住院老年患者患CDI的风险最高。粪便移植是治疗CDI的一种很有前途的治疗方法。
通过以上的检索，使作为一名刚刚脱离象牙塔学生的我对于检验这一门专业又有了深刻的理解，不仅仅是学到了艰难梭菌的相关知识，更重要的是我知道了任何一种疾病的诊断是复杂的，任何一个检测的结果都不能单独的解读，要综合各种信息，这让我想起了导员毕业前的讲话，脱离学校，学医的路才刚刚开始，路漫漫其修远兮，吾辈将在医学的赛道上“艰难”求索............
致谢：感谢河北医科大学第二医院赵建宏教授对本文的指导。
参考文献TD, Davies KA, Coen PG, et al. Differences in outcome according to Clostridium difficile testing method: a prospective multicentre diagnostic validation study of C difficile infection. Lancet Infect Dis. 2013;13(11):936-945. doi:10.1016/S1473-3099(13)70200-7Dubberke ER, Han Z, Bobo L, et al. Impact of clinical symptoms on interpretation of diagnostic assays for Clostridium difficile infections. J Clin Microbiol. 2011;49(8):2887-2893. doi:10.1128/JCM.00891-11程敬伟,刘文恩,马小军等.中国成人艰难梭菌感染诊断和治疗专家共识.协和医学杂志,2017,8(Z1):131-138.相关阅读
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