nionline 发表于 2023-11-22 14:29

【感染科普笔记2023-11-22】余方友丨结核病实验室诊断新技术开发与应用

本帖最后由 高山雪莲W 于 2024-9-27 15:46 编辑

讲者丨余方友(同济大学附属上海市肺科医院)
整理丨倪明珠(芜湖市第二人民医院)
审核丨王玉兰
来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会
结核病诊治离不开检验,在SIFIC 2023年“全国感控与耐药感染”联合大会上,来自同济大学附属上海市肺科医院的余方友主任详细介绍了结核病的实验室诊断新技术的开发与应用,为早期发现结核病奠定了坚实基础。



一、结核病是导致人类最多死亡的单个疾病
(一)WHO数据:公布的导致人类死亡的主要原因中,2015~2017年结核病是导致人类死亡的十大死因之一,2019年列第13位。
(二)WHO目标:与2015年相比,2035年结核病导致的死亡人数下降95%,发病率下降90%。但是,截至2020年各项既定目标几乎均未能实现,达到2035年“终止结核病策略”的计划任重道远。
(三)WHO公布2009~2016年确诊的耐多药结核病患者数量呈现不断上升的趋势:结核分枝杆菌耐药机制及其多重耐药的出现,主要表现为进入休眠期使得药物摄入减少、持续产生的β内酰胺酶使药物失活、药物外排泵活性增加、基因突变导致药物靶位的改变、前体药物活化酶减少等,结核分枝杆菌的耐药与染色体相关基因突变有关。
二、检验科不断更新找出结核菌的方法
(一)质谱技术作为一种快速的微生物检测技术,能有效的鉴定临床常见快速生长及慢生长的分枝杆菌。原理为每一种微生物都有其独特的蛋白指纹图谱,根据不同的指纹图谱进行菌种鉴定。
(二)生物大分子常用质谱仪种类:基质辅助激光解析离子化(离子源)飞行时间质谱(质量分析仪)技术(MALDI-TOF MS)是通过离子在一定距离真空无场区内按不同质荷比以不同时间到达检测器,从而得到不同峰图,进而区分样本特征的一种检测技术。
根据检测物质的不同,基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS),可以分为两类:蛋白质谱和核酸质谱。
蛋白质谱和核酸质谱优缺点一览表


(三)核酸飞行时间质谱可对临床样本直接进行分枝杆菌菌种鉴定与耐药基因突变检测

[*]检测物质是PCR产物,可直接检测痰样、灌洗液等临床标本。
[*]结合扩增与延伸两步PCR,SNP检测的准确度较高。
[*]实验设计灵活,可以鉴定基因型,也可以鉴定耐药基因突变。
[*]通量较高。

(四)临床研究项目介绍:核酸飞行时间质谱技术预测结核分枝杆菌耐药性
[*]在168株结核分枝杆菌临床分离株中,利用核酸基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱技术对结核分枝杆菌耐药性进行预测分析。核酸质谱可以实现结核分枝杆菌药物敏感性的快速检测,是预测结核分枝杆菌耐药性的有效辅助检测手段。
[*]研究对象:从上海市肺科医院菌株库中随机选取115株利福平耐药和53株敏感结核临床分离株。进行3种一线抗结核药物(利福平、异烟肼、乙胺丁醇)以及5种二线药物(链霉素、阿米卡星、氧氟沙星、卡那霉素、莫西沙星)耐药性鉴定。
[*]结果:56株分离株(33.3%)核酸质谱检测无耐药突变。其余112株中,核苷酸MALDI-TOF MS的总耐药率如下:利福平(106,63.1%)、异烟肼(91,54.2%)、乙胺丁醇(50,29.8%)、链霉素(64,38.1%)、阿米卡星(14,8.3%)、卡那霉素(15,8.9%)和氟喹诺酮类(44,26.2%)。

(五)研究项目介绍:我院基于纯培养物的全基因组测序检测药敏
[*]目的:评价全基因组测序(WGS)对结核分枝杆菌(MTB)耐药的预测效果。
[*]方法:随机抽取上海市肺科医院276株耐利福平结核和30株利福平敏感结核临床分离株。对6种抗结核药物进行了表型药敏试验(DST),并使用在线“TB-Profiler”工具进行了WGS预测耐药性。
[*]结果:以表型敏感性为全标准,异烟肼、利福平、乙胺丁醇的敏感性和特异性分别为94.53%和92.00%、97.10%和100.00%、97.46%和64.36%。链霉素组分别为97.14%和95.83%,氧氟沙星组分别为93.02%和98.87%,阿米卡星组分别为75.00%和100.00%。
[*]结论:WGS可作为预测异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星和阿米卡星耐药的有效方法。

(六)基于PCR方法的分子药敏检测方法的优缺点
[*]优点:快速,当天可报告;操作简单,有些甚至是POCT;对实验室要求不高;可对临床样本进行直接检测。
[*]缺点:价格最贵,贫困地区造成患者的经济负担加重;检测的药物少;覆盖的突变位点少,无法检测覆盖区域外的突变;不能评价突变与耐药水平之间的关系,与耐药无关的突变可导致假阳性;不知道或部分知道具体的突变位点。

(七)全基因组测序在结核分枝杆菌药敏应用的优势
[*]减少处理活结核培养物带来的生物危险。
[*]减少活结核杆菌运送到参考实验室进行检测。
[*]可以全面分析抗结核药物的耐药性,除基因突变外,还可以分析插入和缺失。
[*]一次分析可获得全面的基因组信息,除预测药物敏感性外,还可进行菌种鉴定、致病性预测和传播方式等,为流行病学调查提供数据。
[*]有希望替代已有的所有分子生物学检测结核杆菌的方法,单个测试价格虽高,但比多种方法总和的价格低。
[*]是非常有前途的结核杆菌分子药敏方法,比传统培养药敏方法所需时间短。
[*]可以检测敏感和耐药结核杆菌混合感染。
[*]数据可储存,若有新的耐药基因或突变位点被发现可用于预测其耐药性。
[*]更加敏感并且可检测到种群是1%的异质耐药性。

(八)WGS用于结核分枝杆菌药敏
[*]二代测序技术是最有前途的全面解决分子药敏的技术,但还面临诸多的问题需要解决,商品化在临床使用还有一段路要走,基于纯培养的二代测序方法预测药敏结果可靠性高,但对临床样本进行直接测序还面临挑战,结果不理想。
[*]对结核杆菌耐药机制的了解不够是制约分子药敏技术的因素。
[*]与基因突变无关导致的结核分枝杆菌耐药二代测序很难检测。

(九)tNGS:靶向高通量测序
是针对分枝杆菌的多个靶标分型区段、基因特点,设计特异性引物,采用超多量PCR技术,对目标序列进行靶向扩增富集后测序,通过靶向高通量测序(tNGS)实现分枝杆菌的广谱、精准分型鉴定。
小 结
结核病防治第一步在检验科,只有实现早期诊断、精准诊断、快速诊断,才能更好开展后续的防和治。上海市肺科医院检验科运用MALDI-TOF MS对分枝杆菌进行菌种鉴定取得良好效果的先进做法值得借鉴。
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随遇而安7 发表于 2023-11-22 14:52

感谢老师分享,路过已学习

LJMX0211 发表于 2023-11-22 15:36

谢谢老师分享,涨知识了       

黄赋颖院感科 发表于 2023-11-23 11:23

谢谢老师分享,已学习!

c陈思s 发表于 2023-11-23 14:03

谢谢老师分享,已学习!
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