【感染科普笔记2023-10-26】沙巍丨CRISPR技术在结核病诊断中的应用
本帖最后由 吴晓梅 于 2024-9-27 15:39 编辑讲者丨沙巍（同济大学附属上海市肺科医院）
整理丨王红丽（开封市人民医院）
审核丨卢珊（开封市人民医院）
来源丨SIFIC 2023“全国感控与耐药感染”联合大会
结核病是一个久到可以与人类历史同步的疾病，联合国计划在2030年，中国计划在2035年消灭结核。但事实上，结核并不是那么容易被彻底消灭，需要包括疫苗、诊断工具、治疗药物等各方面能跟得上结核病的不断迭代。随着技术的突破、研发的进步，结核病在诊断治疗方面都有所进展。同济大学附属上海市肺科医院沙巍教授对CRISPR技术、研发的TB-QUICK平台进展进行了详细的讲解，对临床医生结核病的诊断方法选择提供了帮助。
一、目前全球及我国结核病疫情概论
[*]结核病发病率
我国2021年估算的结核病的新发患者数为78.0万（2020年84.2万）；2021年估算结核发病率为55/10万。在30个结核病高负担国家中，我国估算结核病发病数排第三。2021年全球新发结核病患者1060万，发病率为134/10万，新诊断的结核病患者达到640万。与2019年相比，新诊断报告的结核病人例数大幅度减少，这是比较让人担心的事情。
2.结核病病原学检出率
随着近几年分子生物学技术的运用，我国结核病原学检出率低的情况得到了明显改善，检出率近几年逐步上升，2021年达到了58%。在2021年全球新诊断出的640万例结核病患者中，有38%是通过快速分子诊断的，高于2020年的33%和2019年的28%。
3.CRISPR诊断技术是“下一代诊断技术”
常规的分子生物学检测存在着一些不足的地方，主要是在菌阴结核病中敏感性不高、稳定性不高、偏移较大。相对于现有的技术而言，CRISPR技术更加快捷精准，更适合便携自测。未来，在临床技术领域，将形成PCR 、NGS（二代测序） 、CRISPR三足鼎立的状态。CRISPR诊断技术是值得关注的技术之一。
二、研究基础
[*]CRISPR是微生物的“免疫系统”
短重复序列是来自过去入侵者的核苷酸，构成过去感染的遗传记忆，形成CRISPR RNA(crRNA)。CRISPR相关（Cas）蛋白和crRNA可形成有效的核糖核蛋白（RNP）复合物，以检测和降解与crRNA序列互补的外源核酸。CRISPR系统已广泛应用到基因组编辑酶。
2.现有的CRISPR-Cas系统分为两类
● class1：包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ类，具有基于Cas7主基亚基的多亚基复合物。
● class2：包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ类，是单亚基酶。
3.HOLMES（an one-HOur Low-cost Multipurpose highly Efficient System）系统
检测原理为：若样本中存在目标DNA，crRNA就能与扩增后的targetDNA结合形成Cas12a/crRNA复合物，激活Cas12a反式切割活性，从而通过荧光探针检测到信号。检测步骤为：提取核酸→目标DNA扩增（PCR/LAMP/RPA）→基于Cas12a的反式切割→信号检测。
在第一代的HOLMESV基础上，又发展到第二代HOLMESV技术，第二代HOLMESV使用的酶是Cas12b，较之Cas12a的优点是更耐高温，更稳定；可与等温扩增技术LAMP联用，从而大大增加检出效能。
三、TB-QUICK平台的建立及多中心临床研究结果
（一）早期的理论研究
[*]TB-QUICK平台以结核分枝杆菌IS6110为靶点，2h内可检测到低至1.3拷贝/μl的结核分枝杆菌DNA。
[*]在肺结核样本中，TB-QUICK子所有结核患者中的敏感性为86.8%，特异性为95.2%，高于分枝杆菌培养66.7%和xpert70.4%。
[*]TB-QUICK在菌阴性肺结核患者中的敏感性达到80.5%，高于分枝杆菌培养46.2%和xpert57.1%。
[*]在TB-QUICK检测结核分枝杆菌DNA时，对镜检涂片阳性的敏感性为41.2%，对镜检涂片阴性的敏感性为31.7%。
（二）进一步开展前瞻性、探索性、多中心研究
[*]参与研究的单位既有结核病定点医院，也有综合医院。
[*]研究目的：对CRISPR-Cas12Bholmev2平台检测技术对肺结核的诊断价值的进一步验证。
[*]当前研究进展：目前已入组488例，其中经过TB-QUICK检测及复核，并收集齐全相关临床及实验室数据者共77人，TB-QUICK在菌阴肺结核患者中的敏感性达71.4%，高于分枝杆菌培养50.8%和xpert40.0%。
（三）TB-QUICK平台的意义---为结核病的防控提供更多帮助
[*]根据世界卫生组织的指导方法，结核病的诊断工具特点是准确，价格合理，无需专门的实验室仪器，医护人员操作简便的及时检测。
[*]TB-QUICK中，一个简单的水浴可能足以检测（65℃下的LAMP反应和48℃下的CRISPR-Cas12b反应），样本自动化预处理的TB-QUICK平台将有助于其在缺乏现代化设备的地区使用。
[*]TB-QUICK提供了一种替代的分子诊断方法，用于结核分枝杆菌的检测，尤其是在菌阴肺结核患者的样本中检测优势更为明显。
四、国内外学者的研究成果
[*]胡晔教授团队“一项关于CRISPR检测成人和儿童（包括感染艾滋病毒的儿童）外周血游离结核分枝杆菌DNA的分子诊断研究”结论：对于酶抑制的患者，在外周血中cfDNA的检出概率比较高。
[*]逄宇教授团队“基于CRISPR/Cas13a检测临床标本中结核分枝杆菌的诊断试验的开发和临床评价”结论：CRISPR-MTB检测法在痰、BALF和脓液样本中具有良好的灵敏度和准确性。
[*]CRISPR在检测耐药结核病中的应用--FLASH平台：FLASH-TB具备从痰样本中检测结核分枝杆菌耐药性的潜力。
【总结及展望】
[*]新冠肺炎大流行对结核病诊断和治疗产生持续性的负面影响，结核病的诊疗进展出现放缓，停滞甚至逆转，全球结核病目标偏离了轨道，研发新型肺结核诊断技术迫在眉睫。
[*]CRISPR技术诊断肺结核病是非常值得关注的技术之一，目前已发表的国内外学者的小样本研究中展示出其强大的诊断效能，并有潜力对耐药结核的诊断及机制进行探索研究的。
[*]结核病诊断仍然面临一个比较大的挑战，CRISPR技术将来会慢慢从实验室走到临床，未来仍有一些技术需要解决。
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封面图片来自网络图文：王小虾
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