nionline 发表于 2023-7-12 17:25

【感染科普笔记2023-7-12】何军丨讨论mNGS技术在本地化持续建设之路

本帖最后由 吴晓梅 于 2024-9-28 10:23 编辑

讲者丨何军(苏州大学附属第一医院)
整理丨李振欣(辽宁省肿瘤医院)
审核丨江云兰
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染” 联合大会
mNGS技术的普及和发展离不开基础技术平台的构建和发展。来自苏州医科大学附属第一医院的何军教授从申请流程、场地设置、人员培训、技术流程、室间质控等方面细致详尽的向我们介绍了mNGS技术平台本地化建设的流程和注意事项。并强调为保障mNGS技术本地化持续发展,应重视实验室内部和实验流程的质量控制,注重人才培养和科技成果转化,加强临床沟通,走好专科化、特色化道路。不断提升社会和经济效益价值。



一、讨论mNGS技术在本地化持续建设之路mNGS是一种宏基因组基因测序技术,在建设过程中开展经验分享,为大家在今后工作中有所启发。我国2018年开始建设平台,2019年、2020年开始发表一些研究成果。不同领域专家共识不断增加和日益完善。
二、建设mNGS技术平台在本地化开展的优势
[*]采集样本的规范化根据临床需求,可同时采集不同感染部位或途径的样本。
[*]降低运输风险减少标本运输过程中带来的生物安全问题。
[*]缩短报告周期节约物流及沟通时间,对临床需求快速反应。
[*]提高解读能力充分高水平传统微生物检定经验,可以促进mNGS病原体报告的精准审核,结果解读及临床沟通。
[*]促进学科发展1)促进传统病原微生物培养、血清学诊断、PCR分子检测等技术人员水平与检验质量的提升;2)促进医院多个感染相关临床科室发展,提升临床诊断水平,学科及人才队伍建设;3)优势最大化,建立本地化数据库、样本库,严格质控,精准解读,助力临床诊断。

三、建设mNGS技术平台院内开展的申请流程
[*]项目前期调研及评估→向医院职能部门提出开展新技术申请→获批后由职能部门开展相关招标工作→组建实验室建设(实验室建筑设计、装修、设备、人等)。
[*]建立项目性性能确认方案→完成实验室操作、数据库评价、生信分析性能确认→完成项目性能确认报告、完成标准实验操作规程及相关记录表格的书写及设计→完成人员培训、实验室内外对比测评。
[*]在医院内部召开临床沟通会(重点学科全覆盖)→医院职能部门审核:收费价格、医保比例、信息对接、报告发布→标本采集的培训及发放标本容器→在医院内网公布项目开展通知及相关事项。

四、mNGS技术本地化开展的基本要求
[*]场地资质:面积、资质(备案)、人员(证书)。
[*]设备平台:测序仪、数据库、分析软件、其他配套设备。
[*]人员要求:实验室人员技能、生物信息分析人员、结果报告解读、临床协调。
[*]试剂耗材:试剂种类多、质量评估、专用(文库、测序、耗材)。
[*]技术流程:标本前处理、核酸提取、文库制备、上机测序、数据库更新。
[*]管理制度:标准化操作、室内质控标准化、室间质控对比、临床与科研提升。

五、实验室场地设计的建议(一)场地设置建议
[*]试剂准备区:试剂分装;
[*]样本制备区:核酸提取;
[*]文库构建一区:文库制备、接头标签;
[*]文库构建二区:文库纯化、文库质检;
[*]测序区:上机测序;
[*]电泳区:过程质检;
[*]单向流设计,切勿逆行。

实验室场地设置必须按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的相关规定开展临床mNGS。检测实验室应符合《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作指导》的相关规定。同时,有相应的专业技术力量:人员、仪器、技术、相关的实验室资质(PCR实验室资质、NGS试点单位资质等)。
(二)测试平台及配套试剂


(三)人员要求实验室应该配备满足开展平台检测要求的医学、检验、生物信息学等专业人员。
[*]实验室人员:参加相关培训并取得国家相关证书,如:国家基因扩增检验实验室技术人员岗位培训合格证书(感染类)。
[*]生物信息分信息人员:掌握mNGS检测原理及生物信息软件,具备数据信息维护及管理,开发新算法及更新数据库的能力。
[*]报告解读及报告签发人员:具备临床医学、微生物学和分子生物学背景,掌握相关临床诊疗指南。

(四)技术流程-实验操作
[*]样本采集:①严格的无菌技术,将污染的可能性降至最低。②采取适当的采样位置和技术,推荐采集感染原发部位的样本。③正确选取采集/储存容器,容器均为一次性使用,且保证无污染。
[*]核酸提取:去除人源细胞。
[*]核酸抽提及文库建立:文库制备流程中需要对每次提取的核酸样本进行样本定量检测,以确保核酸质量。
[*]上机测序。

(五)技术流程-结果分析碱基识别→数据质控→去宿主序列→病原数据库对比/耐药数据库对比→病原鉴定/耐药鉴定→报告解读。
注意事项:①建议测试序列读取长度不少于50bp,有效测序数据量不低于20M。②推荐使用临床应用级别的数据库,病院数据涵盖细菌、真菌、病毒、原虫等多种病原菌微生物。③剔除试剂、环境中引入的假阳性病原体信息。
(六)室内质量控制
[*]核酸总量及纯度:影响病原的检出,易受背景菌的影响。
[*]文库总量:影响病原的检出。
[*]插入片段长度:过大(破碎异常),过小(基因组降解)。
[*]扩增比例:比例异常提示标本质量差或文库构建失败。
[*]Q30:衡量测序准确度。
[*]Clean Reads:高质量数据低影响病原检出。
[*]Pathogen Reads:提示样本中微生物含量。
[*]参考品:内参和外参(阴性和阳性)。

(七)室间质量评价2020年国家卫生健康委临床检验中心组织开展mNGS室间质评工作,旨在评估mNGS敏感性、特异性,报告解读及近缘物鉴定等能力。
六、保证mNGS技术本地化持续建设的保障
[*]实验室全流程关键点质量控制样本采集:采集时间、部位、样本量、状态、运输温控。核酸提取:总量、纯度、浓度。文库构建:文库总量、片段分布、扩增比例。上机测序:读长、数据量、测序质量。生信分析:Clean Reads、Pathogen Reads、阴性对照。结果解读:序列数、覆盖度、相对丰度。
[*]实验室内部关键点质量管理人员:员工培训及能力验证。仪器:新仪器验证、使用中仪器验证、年度校验。试剂耗材:性能验证、背景菌验证。环境:温湿度、防污染措施。方法、文件:操作步骤规范化、方法学的更新及完善、关键点的质量控制、完善实验流程记录。
[*]有效、不断召开临床沟通会:专科化、特色化发展。
[*]科研成果是持续发展的动力。
[*]社会和经济效益是持续发展的价值体现。
[*]培养综合性人才是难点。

分析mNGS检测结果,能结合其他实验诊断,临床诊断和治疗信息,给予临床提示性结果的综合性人员;具有能与临床沟通、合作,发现新的诊疗手段,凝练以临床为导向科研方向的综合性人才。
小 结:随着mNGS技术的不断完善,院内外机构合作,在本院开展mNGS技术检测感染性病原体的时机已非常成熟。应重视实验各环节的质量控制,最重要的还是样本采集的时机和标本类型、操作人员的实验技能、完善的数据库、技术方法的不断更新。提高检验人员从事并能熟练掌握生信分析的能力及水平,充分利用实验数据及临床资料,善于发展问题并不断解决问题,实现mNGS技术对感染性病原体精准诊断和治疗价值。重视与临床的沟通和合作,定期召开临床沟通会,善于总结及提升对临床病例的分析能力,才能使该项目在院内持续发展。
封面图片来自网络   图文:王小虾


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