【感染科普笔记2023-6-30】李园园丨mNGS在风湿免疫疾病伴弥漫性肺病变患者中的诊断价
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讲者丨李园园（中南大学湘雅医院）
整理丨李振欣（辽宁省肿瘤医院）
审核丨秦海燕（昆明市第一人民医院）
来源丨SIFIC 2022“全国感控与耐药感染”联合大会
由于风湿免疫疾病伴弥漫性肺病变疾病其肺部感染复杂，疑难危重高发，病程发展迅速等特点，快速、准确明确病因有重大意义。来自中南大学湘雅医院的李园园教授详解介绍mNGS的特点及应用现状，并通过列举典型病例讲解mNGS在风湿免疫疾病伴弥漫性肺病变疾病诊断中的应用。
风湿性疾病是一组自身免疫性及炎症性疾病，其特征为炎症反应以及关节、软组织和内脏的损害。由于诊断和治疗广泛及死亡风险增高，并发弥漫性肺部病变的风湿性疾病是呼吸病和风湿病专家在临床常规中重要和富有挑战性的领域。区分肺部感染性疾病和继发于风湿病的肺部非感染性疾病以及之后的识别病原体至关重要。
免疫抑制宿主肺炎病程特点包括：①病程发展快呼吸衰竭为主要表现。②迅速发展为重症，ARDS。③合并MODS脓毒。④症治疗时间长、预后差。
由于肺部感染病原构成复杂，新发未知病原体流行频现，肺部病原体明确较为困难。肺部感染复杂，疑难危重高发，病程发展迅速，医患关系压力巨大。因此：感染性疾病呼唤精准医疗。
一、mNGS的特点及应用现状
宏基因组测序技术缩短新发传染病病原的检定时间。可用于病原体检测，无需预测、无偏好、一次检测成千上万种病原体、可检出新发传染病。mNGS技术缩短检测时间、提高检测阳性率、用于优化抗菌药物管理，带来临床收益，被临床普遍认可。
（一）病原体高通量测序临床应用适应症2019-2020年国内专家共识指出，病原体高通量测序临床适应症包括：
[*]疑难：不明感染、多重感染、不明原因发热。
[*]危重：脑膜炎等神经系统感染、肺炎等多种呼吸道感染、脓毒症等血液感染其他危急感染。
[*]特殊：HIV继发感染、器官移植术后感染、免疫异常相关感染。
（二）呼吸系统感染临床送检适应症
[*]推荐1：疑似LRTIs(肺炎、肺脓肿、支气管扩张伴感染等)的危重症患者，建议送检mNGS。
[*]推荐2：免疫功能抑制患者的呼吸系统感染，建议送检mNGS。
[*]推荐3：疑似慢性肺部感染或难治性感染，且既往治疗效果不佳时，建议送检mNGS。
[*]推荐4：疑似呼吸道感染暴发且病原体不明，建议送检mNGS
[*]推荐5：通过有创性操作获取的组织标本，如经皮肺穿刺组织。经支气管镜肺活检组织(TBLB)及经超声支气管镜淋巴结穿刺活检组织(EBUS-TBNA)等，建议送检mNGS。
[*]推荐6：怀疑厌氧菌引起的肺脓肿、坏死性肺炎或其他肺部感染，建议采集避免口腔菌群污染的标本(如下呼吸道标本、经皮穿刺肺活检组织及胸腔积液)，送检mNGS。
（三）标本选择和取材1. 标本选择单纯下呼吸道感染：BALF（优于痰）。合并脓毒血症、败血症：+血标本。合并其他部位感染：颅内感染（+脑脊液）；胸腔感染（+胸水）。
2. 不同标本的优缺点如下表
3. 标本采集、送检、质控（参考国内共识）选择有资质的机构进行送检1）采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则。2）样本应直接从患者感染部位的液体或组织中进行采集。3）患者存在感染表现但病情危重但不能承受有创操作时，可考虑采取患者的血液样本送检。4）实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程。5）每次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对招品，每批次实验均需严格评估是否存在操作或坏境带来的污染，单个样本测序特异性序列片段数建议不低于20M特异性序列数。此外建议序列读长不少于单端50bp。6）对数据进行分析时，建议采用临床应用使别的数据库，审慎使用公共数据库。7）建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量，序列读长，以及相关的质控参数。
（四）结果解读1. 阳性价值：病原菌鉴定和病毒分型1）二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证。2）对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根据推荐意见采集合适的样本进行二代测序，根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断，同时应注意排除检出病原体定植的情况。
2. 检测阳性≠致病病因临床挑战：检出病原体与疾病的关联性。判读依据(综合判断)：1）检出序列数(检测结果)：降序排列(检出序列数越高，致病可能性越大)。2）致病性(结果说明)：疾病相关程度(疾病相关程度越高，致病可能性越大)。
3. 阴性价值【病例】入院病史：女，18岁，腹痛1天，全身多器官功能不全就诊于某医院急诊科。诊断：多脏器功能衰竭原因不明，特殊感染待查。mNGS检测结果：送检血液标本，未检出任何病原菌。后续确诊患者非感染，考虑海鲜过敏所致。
4. 检测阴性=排除感染？临床挑战：未检出病原菌与疾病关联性。对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结果(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测。
5. 造成mNGS结果假阴性的常见原因1）某些感染病原体的载量低于mNGS的检测限。2）在核酸提取过程中，一些病原体(如真菌)的细胞壁较厚很难破壁，可能导致核酸产率较低。3）一些菌株在预处理过程中DNA易被裂解剂降解。4）只进行mNGS的 DNA检测，可能遗漏以RNA为遗传物质的病毒。5）取材不佳。
（五）认识NGS的局限性
[*] 背景菌判断困难。
[*]病原基因组覆盖度有限：测序数据中宿主人的序列太多，可能会掩盖部分低丰度的病原微生物信息。
[*] 胞内菌(含量低)/真菌(细胞壁厚)检出低。
[*]RNA病毒(易降解/转录本丰度和复杂度高)检测要求高耐药基因检测存在一定困难。
[*]检测价格高。
[*]结果与标本质量密切相关。
[*]需要临床医生的综合判断和决策强烈建议与其他检测手段综合应用，成为病原学快速诊断检测体系。
二、mNGS在风湿免疫疾病相关弥漫性肺疾病诊断中的应用
（一）典型病例1. mNGS检测阳性病例一般情况：患者女，75岁，农民。既往史：ANCA相关性血管炎，长期使用激素及免疫抑制剂主诉:活动后气促10余天。入院诊断：1、重症肺炎I型呼衰2、ANCA相关性血管炎诊疗：呼吸支持 V-V ECMO。在诊疗过程中，根据BALF-NGS病原学检测结果，进一步完善诊断：1.重症肺炎(PJP肺炎为主)，I型呼吸衰竭2.ANCA相关性血管炎，显微镜下多血管炎，间质性肺炎3.中度贫血4.低蛋白血症。抗感染治疗使用：SMZ+左氧+卡泊芬净，诊疗有效。
2. mNGS检测阴性病例一般情况：女，45y，既往体健主诉：乏力10天，气促1周，加重2天入院诊断：1.重症肺炎？I型呼衰ARDS 2.间质性肺炎：结缔组织疾病相关？特发性？诊疗：呼吸支持：气管插管接有创呼吸机辅助通气，经验性抗感染治疗：左氧0.5ivgtt qd病原学送检：取BALF送检常规检查+NGS。BALF-NGS病原学检测结果均未见异常结果。进一步根据特发性肌炎抗体谱完善诊断：抗合成酶抗体综合征。诊疗：原发病诊疗：激素+血浆置换，预防性抗感染治疗：左氧，1周内脱机改鼻高流量氧疗，后转普通病房进一步治疗，病情好转后风湿科随访，病情稳定。
（二）本团队相关研究成果mNGS在风湿性疾病伴弥漫性肺病变病原体识别中的价值：一项回顾性研究期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology JCR分区：Q12021IF：6.073
1.纳入标准2018年7月至2022年5月湘雅医院呼吸 ICU救治的有风湿免疫基础疾病的成年患者；肺部CT显示新发双肺弥漫病变患者完善传统微生物学检查，同时BALF送检mNGS检测。
2.排除标准年龄小于18岁；BALF标本未进行mNGS检测临床资料不全。
3.研究结果（1）临床症状一共纳入患者98例女性58例，男性40例，中位年龄为58岁。风湿免疫疾病合并肺部弥漫病变患者最常见的临床表现：呼吸困难(100%)、发热(90.8%)、咳嗽(87.8%)、咳痰(71.4%)。患者中最常见的风湿免疫疾病依次为：类风湿性关节炎(22.4%)、多发性肌炎/皮肌炎(21.4%)、血管炎(19.4%)、系统性红斑狼疮(14.3%)、干燥综合征(10.2%)。约一半(49.0%)的患者需要有创机械通气，其中23.5%的患者以治疗失败告终。
（2）感染及病原学特征71.4%的风湿免疫疾病+双肺弥漫病变患者有肺部感染证据，细菌感染(42人)>真菌感染(32人)>病毒感染(27人)。所有患者中，肺部混合感染率为38.8%，尤其是真菌或病毒感染患者中混合感染很常见在感染真菌或病毒的患者中，混合感染的发生率显著高于单一感染。
（3）mNGS与传统方法检测效能比较mNGS检测任一病原体或混合感染病原体的效能均显著高于传统方法。mNGS相比传统检测方法具有更高的灵敏度(971%vs571%P<0.001)和阴性预测值(92.9%vs.47.4%P<0.001)。而其特异性(92.9%对96.4%，P=0.553)和阳性预测值(97.1%vs97.6%P=0.896)与传统检测方法相当。mNGS在细菌、真菌、病毒感染中均有很好的检测效能。尤其是培养困难的病原体(如肺孢子菌、奴卡菌等)中具备独特优势。
（4）mNGS对临床诊疗策略的影响BALF标本mNGS结果回报后，29.6%患者增加糖皮质激素剂量，8.2%患者减少了糖皮质激素剂量。62.2%的患者抗菌谱发生改变，28.6%的患者缩小了抗菌谱，20.4%的患者抗菌药物降阶梯。
（5）风湿免疫疾病+双肺弥漫性病变患者的临床管理流程
[*]早期、充分的呼吸支持
[*]24小时内启动快速病原学检测(包括mNGS+传统方法)，mNGS在感染与非感染疾病中均有重要价值。
[*]精准抗感染的基础上予以风湿免疫疾病治疗。
[*]注重MDT团队的作用。
小 结
mNGS在风湿疾病并肺部弥漫性病变诊疗的过程中有着重要价值。肺部感染，特别是混合性感染，在并发弥漫性病变的风湿病患者中十分常见。肺部弥漫病变引起呼吸衰蝎，危及生命，迫切需要快速诊断，精准治疗，改善不良预后。合并呼吸衰竭时，尽快启动含BALF-mNGS的联合检测。由于mNGS技术的高效性和广病原体谱，在特殊病原体感染引起的肺部弥漫病变的诊断上有不可替代的优势，指导抗菌药物精准治疗。mNGS检测同时为非感染性因素引起的肺部弥漫性病变提供依据，便于原发病治疗，减少抗生素过度使用，为合理用药打下基础。
封面图片来自网络图文：王小虾
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